Annexin V/PI 流式細胞凋亡檢測試劑

產(chǎn)品簡介
        細胞凋亡是細胞的基本特征，它在機體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和一些疾病發(fā)生過程等方面起著十分重要的作用。Annexin V 是檢測早期細胞凋亡的*靈敏指標(biāo)之一。正常細胞中，磷脂酰絲氨酸 (PS)只分布在細胞膜磷脂雙分子層的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸發(fā)生外翻，暴露于細胞質(zhì)膜的外側(cè)。在體內(nèi)，巨噬細胞可以識別翻轉(zhuǎn)的 PS，從而將這些程序性細胞凋亡的細胞**，因此凋亡過程中并不伴隨局部的炎癥反應(yīng)。Annexin V 是一種分子量為35-36kD 的與磷脂酰絲氨酸有高度親和力的 Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，因此能夠利用 Annexin V 與細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸相結(jié)合的性質(zhì)，檢測細胞的早期凋亡。將 Annexin V 進行綠色熒光 (FITC) 標(biāo)記，以標(biāo)記了的 Annexin V-FITC 作為探針， 利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶 (PI)是一種核酸染料，它不能透過具備完整細胞膜的正常細胞和早期凋亡細胞，但能夠透過凋亡中晚期的細胞和壞死細胞的細胞膜而將細胞核染色，在特定激發(fā)光條件下呈現(xiàn)紅色。

        將 Annexin V-FITC 與 PI 匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，若橫坐標(biāo)表示 Annexin V 信號，縱坐標(biāo)表示PI 信號，則左下象限 (Annexin V-/PI-)  **活細胞；右下象限(Annexin V+ /PI-)  **早期凋亡細胞；右上象限(Annexin V+ /PI+)**凋亡晚期細胞和壞死細胞；左上象限(Annexin V-/PI+)  被認為是許可范圍內(nèi)的檢測誤差。

檢測方法

         利用流式細胞儀或者熒光顯微鏡檢測懸浮細胞或者貼壁細胞中的綠色熒光信號（Annexin V-FITC）以及紅色熒光信號（PI）。

產(chǎn)品特點

         該產(chǎn)品能夠在極短的時間內(nèi)方便、高效、準(zhǔn)確的區(qū)分正常細胞、凋亡細胞和壞死的細胞，并計算各群細胞的比例。
產(chǎn)品組分

運輸及保存方式

        藍冰運輸。-20℃避光長期保存，避免反復(fù)凍融。如短時間內(nèi)需多次重復(fù)使用， 請于 4℃避光保存，有效期半年。

使用注意事項

1、螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請低速短暫離心，將管內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落造成損失。
2、細胞處理需小心操作，避免人為的損傷細胞。
3、細胞凋亡是一個快速和動態(tài)的過程，因此建議在染色后立即進行分析。
4、Annexin V-FITC 和 PI 是光敏感物質(zhì)，在操作時應(yīng)注意避光，盡量減少暴露在光下的時間，必要時請使用帶蓋子的冰盒或者鋁箔紙進行避光操作。
5、使用該試劑盒檢測凋亡是針對活細胞，不需要固定細胞，否則會對結(jié)果產(chǎn)生干擾。
6、如果細胞樣品中含有血小板，請使用含有 EDTA 的緩沖劑并低速離心洗去血小板后再進行檢測，因為血小板含有 PS，能夠與 Annexin V 結(jié)合。
7、對于貼壁細胞，消化是一個關(guān)鍵步驟。貼壁細胞誘導(dǎo)凋亡時如有漂浮細胞， 需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色，操作過程中需嚴格控制胰酶的消化時間， 時間過短，細胞需要用力吹打才能夠脫落，容易造成細胞膜的損傷，使得 PI 攝入過多；消化時間過長，細胞膜同樣會產(chǎn)生損傷，甚至?xí)绊懠毎ど系?PS 與 Annexin V 的結(jié)合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖使胰酶與細胞充分解除，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間，待細胞空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。

8、如果細胞收集過程中使用了胰酶，需注意用 PBS 洗凈去除殘留的胰酶，因為胰酶會消化并降解 Annexin V-FITC，*終導(dǎo)致染色失敗；
9、盡量避免在消化液中使用 EDTA 或者 EGTA，因為 EDTA 和 EGTA 會螯合鈣離子，而 Annexin  V 與 PS 的結(jié)合是依賴于鈣離子的，因此這兩種物質(zhì)的存在或者殘留會影響 Annexin V 與 PS 的結(jié)合，進而影響信號的檢測。
10、成功的檢測凋亡受以下幾種因素的影響，如細胞類型、細胞膜上的 PS 的密度、發(fā)生凋亡時 PS 翻轉(zhuǎn)的比例、誘導(dǎo)凋亡的方法、所用試劑、誘導(dǎo)凋亡的時間以及實驗過程中機械損傷的程度等，把這些因素進行優(yōu)化對實驗成功與否非常重要。請根據(jù)實驗樣本和操作流程對這些步驟進行優(yōu)化后再進行檢測。

實驗步驟

1、懸浮細胞：300 g，4°C 離心 5 分鐘收集細胞；
      貼壁細胞：用不含 EDTA 的胰酶進行消化后，300 g，4°C 離心 5 分鐘收集細胞。胰酶的消化時間不宜過長，以防引起假陽性。
2、用預(yù)冷的 PBS 溶液洗滌細胞兩次，每次均以 300 g，4°C 離心 5 分鐘收集細胞，并盡量去除 PBS 溶液。(可以用大 Tip 上套上小 Tip 去盡量去除 PBS 溶液)
3、加入 100 μl 結(jié)合緩沖液重懸細胞。
4、加入 5 μl Annexin V-FITC 染色液和 10 μl PI 染色液，輕輕混勻。
5、室溫、避光孵育 10-15 分鐘。
6、再加入 400 μl 結(jié)合緩沖液，混勻后置于冰上。
7、立即用流式細胞儀或者熒光顯微鏡進行檢測。

樣品分析

1、流式細胞儀分析
         FITC 的激發(fā)波長不應(yīng)超過488 nm，發(fā)射波長不應(yīng)超過 525 nm，F(xiàn)ITC 的綠色熒光在FL1 通道檢測；PI-DNA 復(fù)合物的**激發(fā)波長為 535 nm，**發(fā)射波長為 615 nm， PI 的紅色熒光在 FL2 或 FL3 通道檢測。用分析軟件繪制雙色散點圖，F(xiàn)ITC 為橫坐標(biāo)，PI 為縱坐標(biāo)。典型的實驗中，細胞可以分成三個亞群，活細胞僅有很低強度的熒光，早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光，晚期凋亡的細胞有綠色和紅色熒光的雙重染色。

2、熒光顯微鏡觀察
        滴加 30-50 μl 用 Annexin V-FITC/PI 雙染色的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞，然后在熒光顯微鏡下用雙色濾光片進行觀察。Annexin V-FITC 的熒光信號呈綠色，PI 的熒光信號為紅色。因此 Annexin V-FITC 陽性的細胞將在細胞膜表面呈現(xiàn)明亮的綠色，而 PI 陽性的細胞則會在整個胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)不同強度的黃-紅色。早期凋亡的細胞只呈現(xiàn)綠色，而壞死和晚期凋亡細胞則會顯示黃-紅色的胞質(zhì)，紅色的細胞核以及環(huán)繞細胞的綠色的胞膜，在晚期凋亡的細胞中還可以觀察到胞膜皺縮和起泡。
【注】：對于貼壁細胞，可直接用蓋玻片培養(yǎng)細胞并誘導(dǎo)細胞凋亡，然后染色后將蓋玻片置于載玻片上進行熒光顯微鏡觀察即可。

常見問題分析

實驗過程中 Annexin V 染不上色或陽性率偏低。

可能的原因如下：
1、確定實驗中的誘導(dǎo)劑是否能夠有效產(chǎn)生凋亡?？梢酝ㄟ^設(shè)定確切凋亡誘導(dǎo)的陽**物對照來排除這一情況。
2、消化液中的胰酶或 EDTA 等是否去除干凈，建議使用無 EDTA 的胰酶進行消化，或者消化后用 PBS 徹底洗滌干凈。
3、細胞用預(yù)冷的 PBS 洗滌后，離心，應(yīng)盡量吸干殘余液體，因為 PBS 中含有的磷酸根離子會與結(jié)合緩沖液中的鈣離子形成磷酸鈣沉淀，進而影響 Annexin V 的染色。
4、結(jié)合緩沖液瓶蓋需蓋緊密封，長時間暴露于空氣中后，空氣中的二氧化碳會與鈣離子形成碳酸鈣沉淀，從而導(dǎo)致鈣離子濃度降低，導(dǎo)致實驗的結(jié)果不佳。
5、吸取完 PBS 的*頭如果不更換，繼續(xù)取結(jié)合緩沖液，也會導(dǎo)致結(jié)合緩沖液中游離鈣離子的減少，導(dǎo)致實驗結(jié)果不佳。
6、陽性細胞的丟失。如果是貼壁細胞，藥物誘導(dǎo)后漂浮細胞也應(yīng)該和貼壁細胞一起收集后合并檢測，漂浮細胞往往是凋亡陽性的細胞，否則丟失漂浮細胞會導(dǎo)致陽性結(jié)果偏低。

實驗過程中陽性率偏高。

可能的原因如下：
1、細胞本身活力太差。若實驗中發(fā)現(xiàn)未經(jīng)誘導(dǎo)凋亡的對照細胞經(jīng)染色后Annexin V+/PI+雙陽性的細胞比例過高，可能的原因是細胞本身活力太差，建議用臺盼藍染色計算細胞活力，拒染細胞比例應(yīng)大于 95%；若活力偏低，建議重新復(fù)蘇細胞，剛剛復(fù)蘇的細胞至少要傳代 3 次以后才能進行該實驗。
2、細胞操作不當(dāng)。貼壁細胞消化過程中避免反復(fù)劇烈吹打?qū)е录毎て茐模訇栃云摺?br/>3、凋亡誘導(dǎo)時間過長。誘導(dǎo)時間過長會使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)耗盡，導(dǎo)致細胞狀態(tài)變差， 假陽性偏高。