EU新生RNA檢測試劑

產(chǎn)品簡介
    細(xì)胞內(nèi)新生RNA的變化是評價細(xì)胞活性的重要指標(biāo)。EU (5-Ethynyl-Uridine) 是一種尿嘧啶核苷類似物, 能夠在細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄時期代替尿嘧啶(U) 摻入新合成的RNA分子中, 然后通過基于EU 與熒光染料的特異性共軛反應(yīng)，把熒光集團(tuán)標(biāo)記到新合成的含有EU 的RNA分子中，這樣就可以進(jìn)行較快的的熒光檢測RNA的轉(zhuǎn)錄活性。本試劑盒將直接測定細(xì)胞內(nèi)新生RNA的變化。
    傳統(tǒng)的檢測新生RNA的方法為以放射性同位素標(biāo)記RNA等方法然后進(jìn)行Southern blot進(jìn)行檢測。但是這種方法需要放射性同位素標(biāo)記及后續(xù)的復(fù)雜操作步驟。利用EU標(biāo)記新生RNA的檢測方法不需要劇烈的RNA變性，只需溫和的細(xì)胞固定化和透化處理，能夠較好地保護(hù)細(xì)胞形態(tài)、RNA整體結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)抗原識別位點，操作步驟更加便捷、靈敏和準(zhǔn)確，能在細(xì)胞水**映新生RNA轉(zhuǎn)錄活性的狀況。該試劑只需要簡單的操作步驟，適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡以及高內(nèi)涵篩選儀進(jìn)行新生RNA的轉(zhuǎn)錄活性。
試劑組分

運輸及保存方式
       藍(lán)冰運輸。-20℃避光長期保存，避免反復(fù)凍融。如短時間內(nèi)需多次重復(fù)使用，請于4℃避光保存，有效期半年。
使用前須知
該試劑是采用成像檢測方法對貼壁細(xì)胞進(jìn)行檢測，適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡等儀器。非貼壁細(xì)胞可在孵育EU后進(jìn)行細(xì)胞涂片處理，固定后再采用貼壁細(xì)胞的染色流程進(jìn)行檢測。
實驗準(zhǔn)備
1、蓋玻片
2、1×PBS（pH7.2-7.6）（用DEPC水配置）
3、含0.5% Triton X-100的PBS（用DEPC水配置）
4、甘氨酸溶液(2mg/ml) （用DEPC水配置）
5、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿
實驗參考

 
實驗步驟(以96孔板，HK2貼壁細(xì)胞為例)
細(xì)胞培養(yǎng)
       取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔4×10³~1×10⁵細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)至正常狀態(tài)。
EU標(biāo)記
      1、將細(xì)胞完全培養(yǎng)基中按照500：1的比例加入EU溶液，制成2×EU標(biāo)記培養(yǎng)基；
      2、提前將2×EU標(biāo)記培養(yǎng)基預(yù)熱，然后等體積加入到細(xì)胞原有培養(yǎng)基中，獲得1×EU溶液，其中EU的終濃度為500 μM；
       注：1）我們不建議替換全部培養(yǎng)基，因為這樣可能會影響細(xì)胞增殖的速度；
              2）配置好的培養(yǎng)基建議現(xiàn)用現(xiàn)配，用量以沒過細(xì)胞為宜；
      3、每孔加入300 μl含EU培養(yǎng)基孵育細(xì)胞2小時，棄培養(yǎng)基；
       注：1）培養(yǎng)時間取決于細(xì)胞的增殖速度和生長狀態(tài)；
              2）孵育時間至少2小時，可延長至24小時后再檢測也可以。
      4、以1×PBS清洗細(xì)胞兩次，每次5分鐘，以除去未摻入RNA的EU殘留。
       注：貼壁不牢的細(xì)胞可降低清洗強度。
細(xì)胞的固定和通透
      1、每孔加入150 μl 細(xì)胞固定液，室溫培養(yǎng)30分鐘，棄固定液；
     注：1) 該試劑盒配備了細(xì)胞固定液，也可以使用含4%多聚甲醛的PBS來進(jìn)行細(xì)胞固定；
            2) 如果使用其他的細(xì)胞固定劑建議用DEPC水來配置，避免RNA酶降解細(xì)胞內(nèi)的RNA。
      2、每孔加入150 μl 2mg/ml 甘氨酸，搖床孵育5分鐘；
      3、棄甘氨酸溶液，每孔加入300 μl PBS洗液，室溫清洗5分鐘；
      4、每孔加入300 μl 0.5% Triton X-100細(xì)胞通透液，室溫通透10分鐘，棄細(xì)胞通透溶液；
      5、每孔加入300 μl PBS洗液，室溫清洗5分鐘；
EU染色
      1、通過用10：1去離子水稀釋10×反應(yīng)緩沖液進(jìn)行配制1×EU 反應(yīng)緩沖液；
      2、按照溶解200 mg緩沖添加劑溶于1 ml去離子水的比例稱取適量的粉末進(jìn)行溶解，即為可用的緩沖添加劑的濃度，建議現(xiàn)用現(xiàn)配；
     注：緩沖添加劑為白色粉末，較難準(zhǔn)確稱量，稱量范圍可稍微放寬，但是不應(yīng)超過±20%，且該粉末較易氧化，使用后請旋緊管蓋，如試劑出現(xiàn)棕黃色，則需報廢或更換。
按照以下的表格進(jìn)行染色反應(yīng)液的配制：

       3、每孔加入100 μl 配置好的檢測混合液，以覆蓋細(xì)胞為宜，避光、室溫孵育30分鐘；
       4、棄染色反應(yīng)液，加入100 μl 0.5% Triton X-100細(xì)胞滲透液清洗2-3次，每次10分鐘；
       5、棄細(xì)胞滲透液，用PBS洗兩次，每次5分鐘。
DNA染色
       1、將Hoechst 33342用RNase-free水溶液1：1000進(jìn)行稀釋得到終濃度為5 μg/ml的1×Hoechst染色液；
       2、每孔加入100 μl 1×Hoechst染色液，室溫避光孵育20-30分鐘后，棄染色液；
       3、每孔加入100 μl PBS洗細(xì)胞兩次，去掉洗液。
圖像獲取及分析
建議染色完成后立即進(jìn)行熒光顯微鏡拍照觀察；如果條件限制，請于4°C條件下避光濕潤保存3天之內(nèi)完成拍照。若為細(xì)胞爬片或涂片，可使用抗熒光淬滅封片劑進(jìn)行封片后于4°C條件下保存及拍照檢測。