A1:首先使用6-8%的分離膠,其次電轉(zhuǎn)時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng),250mA,90分鐘左右。如果同時(shí)需要跑一些分子量小的蛋白,最好將大小兩種膜分開(kāi)轉(zhuǎn)膜
A2:注意以下問(wèn)題:1、 緩沖液中加甲醇的作用是使SDS游離出來(lái),并增加膜結(jié)合蛋白的量,但過(guò)多的甲醇會(huì)使膠收縮,造成大分子在凝膠中的沉淀而降低轉(zhuǎn)膜效率。大分子量的蛋白質(zhì)(如大于60kDa)應(yīng)使用低濃度的甲醇或不使用甲醇。
2、 電轉(zhuǎn)移效果檢查方法:①考馬斯亮蘭染色電轉(zhuǎn)移后的凝膠,檢查是否還有蛋白質(zhì)存留;②麗春紅染色,檢查膜是否吸附了蛋白質(zhì)。
3、 濕式電轉(zhuǎn)方法效率高,半干式電轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)移速度較快。
4、 阻斷劑有BSA、Tween-20、脫脂奶粉和其他動(dòng)物的血清等多種,阻斷的效果不盡相同,如果實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)背景過(guò)高,可以嘗試更換阻斷劑。
5、 一抗和酶標(biāo)二抗的濃度十分重要,濃度過(guò)高,造成背景過(guò)高;濃度過(guò)低造成靈敏度偏低,實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)一抗和酶標(biāo)二抗的效價(jià),對(duì)此參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。此外,一抗的質(zhì)量十分關(guān)鍵,抗體特異性和效價(jià)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
6、 須嚴(yán)格控制假陽(yáng)性反應(yīng),可使用免疫前血清作為陰性對(duì)照,同時(shí)要以抗原作為絕對(duì)的陽(yáng)性對(duì)照,準(zhǔn)確確定陽(yáng)性條帶的位置。
A3:6%左右的膠,電泳的話得試一下,80V,先跑半小時(shí),然后100V跑半小時(shí),0.45mm 的PVDF膜,轉(zhuǎn)膜普通轉(zhuǎn)膜液350MA,90分鐘左右
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