Cell Counting Kit-8 (CCK-8)
細(xì)胞活力檢測試劑盒
使用說明

產(chǎn)品組分

產(chǎn)品簡介
       Cell Counting Kit-8簡稱CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒，是一種利用WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺基苯基）-2H-）進(jìn)行方便的分析四唑鹽，-鈉鹽），其在電子載體1-甲氧基PMS存在下可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原產(chǎn)生高度水溶性的橙黃色的甲瓚產(chǎn)物，屬于MTT的升級產(chǎn)品。將CCK-8溶液直接添加到細(xì)胞中，不需要預(yù)先混合組分。產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物的量（即顏色的深淺）與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。

圖1. CCK-8工作原理圖

       由于CCK-8溶液非常穩(wěn)定并且?guī)缀鯖]有細(xì)胞毒性，因此可以進(jìn)行更長時(shí)間的孵育，例如24小時(shí)至48小時(shí)。CCK-8試劑盒允許靈敏的比色測定法測定增殖和細(xì)胞毒性測定中活細(xì)胞的數(shù)量，檢測靈敏度高于任何其他四唑鹽，如MTT，XTT或MTS。CCK-8法應(yīng)用非常**，如藥物篩選、細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定、**藥物試驗(yàn)以及生物因子的活性檢測等方面。

表1. 細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑的對比表

檢測方法
      利用酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光值。

運(yùn)輸及保存方式
      藍(lán)冰運(yùn)輸。2-8℃避光保存，有效期一年，-20℃保存，有效期兩年，但反復(fù)凍融會(huì)增加背景值。如短時(shí)間內(nèi)需多次重復(fù)使用，請于4℃避光保存。

使用注意事項(xiàng)
    1、確保藥物和CCK-8均勻分布在培養(yǎng)基中。
    2、細(xì)胞增殖越多，顏色越深；細(xì)胞毒性越強(qiáng)，顏色越淺。建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。
    3、對于貼壁細(xì)胞，每孔至少需要1000個(gè)細(xì)胞（100 μl 培養(yǎng)基）。對于白細(xì)胞，由于靈敏度較低，每孔至少需要2500個(gè)細(xì)胞（100 μl 培養(yǎng)基）。推薦的96孔板每孔**細(xì)胞數(shù)為25000。如果使用24孔或6孔板進(jìn)行該檢測，請計(jì)算相應(yīng)的每孔的細(xì)胞數(shù)，并調(diào)整CCK-8的體積，使其為每孔總液體體積的10%。
    4、因?yàn)?span>CCK-8測定是基于活細(xì)胞中的脫氧酶活性，影響脫氧酶活性的條件或化學(xué)物質(zhì)可能導(dǎo)致實(shí)際活細(xì)胞數(shù)與使用CCK-8測定活細(xì)胞之間有差異。
    5、WST-8可能與還原劑反應(yīng)生成WST-8 Formazan。如果使用還原劑（例如一些抗氧化劑）會(huì)干擾檢測。如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除。
    6、孵育2小時(shí)后，背景OD值一般為0.1-0.2單位。并且注意不要在孔中引入氣泡，因?yàn)樗鼈儠?huì)干擾OD值。
    7、如果您想對CCK-8溶液進(jìn)行滅菌，請使用0.2 μm的膜過濾溶液。
    8、CCK-8不能用于細(xì)胞染色。
    9、培養(yǎng)基中的酚紅不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對檢測造成影響。
   10、我們建議將細(xì)胞接種在靠近培養(yǎng)板中央的孔中，***一圈孔中的培養(yǎng)基容易蒸發(fā)，可以用PBS，水或培養(yǎng)基填充這些孔，不作為測定孔用。
   11、如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長，培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，應(yīng)洗滌細(xì)胞更換培養(yǎng)基后再加CCK-8試劑進(jìn)行檢測。
   12、為了您的安全和健康，操作時(shí)請穿著實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套。

實(shí)驗(yàn)步驟

（1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)。
2、接種到96孔板中：按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成細(xì)胞濃度梯度，一般要做3~5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組3~6個(gè)重復(fù)孔。每孔約100 μl細(xì)胞懸液。
3、細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2~4小時(shí)（備注：如果不需要貼壁，這一步可以省略）。
4、每孔加入10 μl CCK-8溶液，由于每孔中加入的CCK-8溶液較少，為了減少試劑沾在孔壁或者*頭帶來的誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻，或者直接配置含10% CCK-8溶液的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。
5、培養(yǎng)箱內(nèi)孵育一定時(shí)間后測定450nm吸光度，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)（即X軸），以吸光度為縱坐標(biāo)（即Y軸）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量。（備注：使用該標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件一定要一致，比如加入的CCK-8溶液的量以及培養(yǎng)孵育的時(shí)間等，以便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量）

（2）細(xì)胞活性檢測
 1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)。
 2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)，每孔約100 μl細(xì)胞懸液，可設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。
 3、細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2~4小時(shí)（備注：如果不需要貼壁，這一步可以省略）。
 4、每孔加入10 μl CCK-8溶液，由于每孔中加入的CCK-8溶液較少，為了減少試劑沾在孔壁或者*頭帶來的誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻，或者直接配置含10% CCK-8溶液的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。
 5、培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5~4小時(shí)：細(xì)胞種類不同，形成的甲瓚的數(shù)量也不一樣，一般情況下孵育1小時(shí)即可。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)**條件。尤其是血細(xì)胞，形成的Formazan很少，需要較長的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。
6、測定450nm吸光度：直接利用酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光值。如果暫時(shí)不測定吸光值可以向每孔中加入10 μl自己配置的0.1M HCl溶液或1% SDS溶液并將培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下，在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

（3）細(xì)胞增殖-毒性檢測
1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)。
2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)，每孔約100 μl細(xì)胞懸液，可設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。
3、細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2~4小時(shí)（備注：如果不需要貼壁，這一步可以省略；或者根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求的不同，培養(yǎng)相應(yīng)的時(shí)間）。
4、每孔加入0-10 μl 不同濃度的待測藥物。
5、培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞：加入待測藥物的培養(yǎng)時(shí)間，需要根據(jù)藥物的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感度以及細(xì)胞的周期來決定，*少要一代以上的時(shí)間。
6、每孔加入10 μl CCK-8溶液，由于每孔中加入的CCK-8溶液較少，為了減少試劑沾在孔壁或者*頭帶來的誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻，或者直接配置含10% CCK-8溶液的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。（備注：如果待測物質(zhì)有氧化性或者還原性的話，可在加入CCK-8溶液之前除去培養(yǎng)基，并用新鮮的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基以去掉藥物對CCK-8檢測結(jié)果的影響。當(dāng)然，如果藥物的影響較小，也可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收值即可。）
7、培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5~4小時(shí)：細(xì)胞種類不同，形成的甲瓚的數(shù)量也不一樣，一般情況下孵育1小時(shí)即可。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)**條件。尤其是血細(xì)胞，形成的Formazan很少，需要較長的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。
8、測定450nm吸光度：直接利用酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光值。如果暫時(shí)不測定吸光值可以向每孔中加入10 μl自己配置的0.1M HCl溶液或1% SDS溶液并將培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下，在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

（4）計(jì)算公式
細(xì)胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)]×100%
**率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)]×100%
As: 實(shí)驗(yàn)孔（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測藥物）的吸光度
Ac: 對照孔（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒有待測藥物）的吸光度
Ab: 空白孔（不含細(xì)胞和待測藥物的培養(yǎng)基、CCK-8）的吸光度

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