EdU細胞増殖檢測試劑盒(紅色熒光)使用說明
產(chǎn)品簡介
產(chǎn)品編號 |
試劑 |
濃度 |
試劑量 |
保存條件 |
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EdU溶液 |
1000X |
40ul |
室溫運輸,4℃長期儲存,勿凍存,熒光試劑請避光保存。 |
反應(yīng)緩沖液 |
10X |
1 ml |
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催化劑溶液 |
25x |
400ul |
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TAMRA 紅 色熒光溶液 |
400x |
25ul |
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緩沖添加劑 |
粉末 |
200 mg |
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Hoechst 33342 |
1000X |
20ul |
使用前須知
該產(chǎn)品是采用成像檢測方法對貼壁細胞進行檢測,適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡等儀器。非貼壁細胞可在孵育EdU后進行細胞涂片處理,固定后再采用貼壁細胞的染色流程進行檢測。也可以應(yīng)用于流式細胞儀檢測。
實驗步驟(以24孔板,HK2貼壁細胞為例)
EdU標記
(a) 將細胞完全培養(yǎng)基中按照500: 1的 比例加入EdU溶液,制成2xEdU標記培養(yǎng)基;
(b) 提前將2xEdU標記培養(yǎng)基預(yù)熱,然后等體積加入到細胞原有培養(yǎng)基中,獲得lxEdU溶液,其中EdU的終濃度為10 uM;
注: 1)我們不建議替換全部培養(yǎng)基,因為這樣可能會影響細胞增殖的速度;
2)配置好的培養(yǎng)基建議現(xiàn)用現(xiàn)配,用量以沒過細胞為宜;
(c) 每孔加入300ul含EdU培養(yǎng)基孵育細胞2小時,棄培養(yǎng)基;
注: 1)培養(yǎng)時間取決于細胞的增殖速度和生長狀態(tài);
2)大多數(shù)**細胞以及粘附細胞系均可采用2小時的孵育時間
(d) 以lxPBS清洗細胞兩次,毎次5分鐘,以除去未摻入DNA的EdU殘留。
注: 貼壁不牢的細胞可降低清洗強度。
細胞的固定和通透
(a) 每孔加入150ul 4%多聚甲醛細胞固定液,室溫培養(yǎng)30分鐘,棄固定液;
(b ) 毎孔加入150ul 2mg/ml甘氨酸,搖床孵育5分鐘,以中和過量的多聚甲醛;
(c ) 棄甘氨酸溶液,每孔加入300 ul PBS 洗液,室溫清洗5分鐘;
(d) 每孔加入300ul 0.5% Triton X-100細胞通透液,室溫通透10分鐘,棄細胞通透溶液;
(e ) 每孔加入300ul PBS洗液,室溫清洗5分鐘;
EdU染色
(a) 通過用10: 1去離子水稀釋10x反應(yīng)緩沖液進行配制1xEdU反應(yīng)緩沖液;
(b) 按照溶解200mg緩沖添加劑溶于1ml去離子水的比例稱取適量的粉末進行溶解, 即為可用的緩沖添加劑的濃度,建議現(xiàn)用現(xiàn)配;
注: 緩沖添加劑為白色粉末,較難準確稱量,稱量范圍可稍微放寬,但是不應(yīng)超過±20%,且該粉末較易氧化,使用后請旋緊管蓋,如試劑出現(xiàn)棕黃色,則需報廢或更換。
(c) 按照以下的表格進行染色反應(yīng)液的配制:
染色反應(yīng)液組分 |
500ul |
1 ml |
2 ml |
5 ml |
IX反應(yīng)緩沖液 |
430ul |
860ul |
1.8 ml |
4.3 ml |
催化劑溶液 |
20 ul |
40 ul |
80 ul |
200 ul |
TAMRA紅色熒光溶液 |
1.2 ul |
2.5 ul |
5 ul |
12.5 ul |
緩沖添加劑 |
50 ul |
100 ul |
200 ul |
500 ul |
(d) 每孔加入100ul配置好的檢測混合液,以覆蓋細胞為宜,避光、室溫孵育30分鐘。
(e) 棄染色反應(yīng)液,加入300 ul 0.5% TritonX-100細胞滲透液清洗2-3次,每次10 分鐘;
(f) 棄細胞滲透液,用PBS洗兩次,每次5分鐘。
DNA染色
(a ) 將Hoechst 33342用PBS 溶液1: 1000 進行稀釋得到終濃度為5ug/ml的 lx Hoechst染色液;
(b ) 每孔加入300ul 1x Hoechst染色液,室溫避光孵育20-30分鐘后,棄染色液;
(c ) 每孔加入300ul PBS洗細胞兩次,去掉洗液。
圖像獲取及分析
建議染色完成后立即進行熒光顯微鏡拍照觀察;如果條件限制,請于4°C條件下避光濕潤保存3天之內(nèi)完成拍照。若為細胞爬片或涂片, 可使用抗熒光淬滅封片劑進行封片后于4°C條件下保存及拍照檢測。
熒光染料 |
很大激發(fā)波長 |
很大發(fā)射波長 |
熒光顏色 |
TAMRA |
541 nm |
567 nm |
橘紅色熒光 |
Hoechst 33342 |
350 nm |
461 nm |
藍色熒光 |
案例圖示
圖注:將HK2細胞分別用DMSO以及Cisplatin進行處理之后,通過我們公司的EdU檢測產(chǎn)品檢測藥品處理是否影響細胞的增殖能力。