兔肺成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定
【簡(jiǎn)介】
體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞多為梭形、多角形和扁平星形等,其形態(tài)尚可依細(xì)胞的功能變化及其附著處的物理性狀不同而發(fā)生改變,成纖維細(xì)胞是功能活動(dòng)旺盛的細(xì)胞,細(xì)胞和細(xì)胞核較大,輪廓清楚,核仁大而明顯,細(xì)胞質(zhì)弱嗜堿性,具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動(dòng);
【材料】
75%酒精、PBS、手術(shù)剪、手術(shù)鑷、EP管、含15%FBS的DMEM(或1640);
【方法】
1、處死兔,開胸腔,取肺組織;
2、PBS洗凈血液,剪碎組織,PBS清洗400R/3min,兩次以上,上清清澈為止;
3、剪碎的組織塊加入0.25%的DNaseⅠ4ml,再加入0.25%的胰蛋白酶消化組織碎塊20min,消化后吸打消化液,靜置2min,取上清,未消化的組織再次加酶液消化20min;
4、取得的上清合為一管,加等量含血清培液終止消化,依次過70um、40um網(wǎng)篩,細(xì)胞懸液1500r / 5min,棄上清,加培液再次離心一次,培液重懸沉淀;
5、細(xì)胞懸液種入培養(yǎng)皿,37°靜置培養(yǎng)30-60 min后輕輕傾斜培養(yǎng)皿,去懸液,補(bǔ)足培液繼續(xù)培養(yǎng),貼壁細(xì)胞為肺成纖維細(xì)胞;
【培養(yǎng)】
DMEM/F12+10%FBS+1%雙抗
【鑒定】
陽(yáng)性:波形蛋白(Vimentin);肌動(dòng)蛋白(α-MSA);