大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定

【簡介】

小膠質(zhì)細(xì)胞是調(diào)節(jié)大腦發(fā)育、維持神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和損傷修復(fù)的大腦常駐細(xì)胞，在大腦正常發(fā)育過程中起著不可或缺的作用，對腦組織尤其是神經(jīng)元起著營養(yǎng)、支持、保護(hù)、監(jiān)視等作用并能根據(jù)微環(huán)境的不同向不同方向發(fā)展；小膠質(zhì)細(xì)胞對維持大腦的穩(wěn)態(tài)及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸傳遞、神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及新陳代謝等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種正常生理活動以及神經(jīng)疾病的病理機(jī)制中都起著十分重要的作用；

【材料】

一）器械滅菌：

手術(shù)器械： 2把眼科直剪，2把彎鑷、2支左右1.5mL離心管、6cm或10cm Dish；

二）溶液準(zhǔn)備：

DMEM/F12培養(yǎng)基、雙抗PBS、75%的酒精、FBS、胰酶；

【方法】

1）3只新生1～2d大鼠75%酒精消毒后， 無菌條件下開顱取出腦組織，放在提前預(yù)冷的D-Hanks液中剝離血管與腦膜并去除所有出血點(diǎn)，將皮質(zhì)和海馬移到呈有D-Hanks液的 15 mL 離心管中；

2）用 1 mL 移液槍輕輕吹打數(shù)下加入0.25%胰酶并輕輕吹打混勻，而后將離心管放入37℃中3min，待液體呈流水狀，基終止消化；

3）終止后的液體通過70μm細(xì)胞篩過濾，收集過濾后的液體并1000 r/min，5 min離心；

4）DMEM/F12清洗2次后細(xì)胞種盤,24小時(shí)第一次換液，第5天再換液，培養(yǎng)第 8 天時(shí)，細(xì)胞明顯分層生長，用10%FBS的DMEM/F12 培養(yǎng)基換液；

5）第9天，將培養(yǎng)基從培養(yǎng)瓶中移到離心管中放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，再將新的10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基注入培養(yǎng)瓶，置于37 ℃恒溫?fù)u床（200 r/min）震搖2 h，收集散落細(xì)胞，直接接種至培養(yǎng)瓶或孔板中，同時(shí)在原混合培養(yǎng)瓶中加入20%FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5d后可收獲第2批小膠質(zhì)細(xì)胞；采用差速貼壁25 min后倒掉新孔板中的培養(yǎng)基，將提前準(zhǔn)備好的第8天換液培養(yǎng)基離心后加入養(yǎng)瓶或孔板中，24h后全換液；

【培養(yǎng)】

DMEM/F12完全培養(yǎng)基

【鑒定】

1）免疫熒光：

陽性：Iba1