SD大鼠支氣管上皮細(xì)胞原代分離培養(yǎng)鑒定
A、無(wú)血清完全培養(yǎng)基制備:
1、Ham'sF12培養(yǎng)基;
2、5μg/ml牛垂體提取物;
3、3mg/ml牛血清白蛋白;
4、0.1μg/ml上皮生長(zhǎng)因子,
5、50μmol/l磷酸乙醇胺;
6、50μg/ml胰島素;
7、50μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白;
8、0.3μmol/l氫化可的松(皮膚抗炎癥);
9、2mmol/l的丙酮酸鈉(培液自有成分);
B、上皮專用培液:
DMEM/F12 1:1、15%FBS、EGF 20 ng/ml、bFGF 25ng/ml、肝素鈉 10ug/ml;
分離方法:
1、大鼠麻醉后,無(wú)菌條件下暴露氣管和肺,截取氣管組織,保留支氣管;
2、環(huán)狀軟骨下方插管,生理鹽水灌洗3次,下端在支氣管末端處結(jié)扎,去除氣管表面結(jié)締組織,PBS清洗干凈,然后灌入1%鏈酶蛋白酶,結(jié)扎氣管分支處,置裝有無(wú)血清培液的培養(yǎng)皿中保持濕潤(rùn),4℃過(guò)夜(或0.25%胰酶4°消化過(guò)夜);
3、消化時(shí)間到后,用F12培養(yǎng)基沖洗支氣管,再剪開(kāi)支氣管用細(xì)胞刷充分刷洗,收集培養(yǎng)皿中的刷洗液,1000r/5min離心洗滌收集細(xì)胞。
4、棄上清后完全培養(yǎng)液重懸37°培養(yǎng),24h后細(xì)胞貼壁換液;
鑒定:
免疫熒光鑒定陽(yáng)性:角蛋白(CK 18);
陰性:Vimentin;