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快速鼠尾基因型鑒定(PCR法)試劑盒

鼠尾基因鑒定 經(jīng)組織消化,PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳等步驟完成檢測(cè)。

快速鼠尾基因型鑒定(PCR法)試劑盒

發(fā)布日期:2019-09-10 瀏覽次數(shù):252

快速鼠尾基因型鑒定(PCR法)試劑盒
說(shuō)明書(shū)


產(chǎn)品組分

組分名稱

M00301-100T

M00301-500T

M00301-1000T

存儲(chǔ)條件

鼠尾裂解液

10 ml

25ml×2

25ml×4

4°C

蛋白酶K

1 ml

1 ml×5

1ml×10

-20°C

2×PCR Easy Mix

1ml

1ml×5

1ml×10

-20°C

 


實(shí)驗(yàn)方法
1、組織消化
    1.1按照小鼠數(shù)量配制組織消化液,試劑比例如下:

 

單樣本

蛋白酶K

10 μl

鼠尾裂解液

100 μl


組織消化液現(xiàn)用現(xiàn)配,充分混勻后使用。
1.2
向每個(gè)含有樣本的EP管中加入100 μl新鮮組織消化液,55°C水浴/金屬浴中消化30分鐘。組織消化時(shí),請(qǐng)務(wù)必將組織完全浸沒(méi)于消化液中。消化完成后,組織外觀上依然完整,但足量的基因組DNA已經(jīng)釋放,不影響后續(xù)的PCR實(shí)驗(yàn)。
1.3
將樣本置于95°C水浴/金屬浴中孵育5分鐘以滅活消化液中蛋白酶。12000rpm離心5分鐘,取上清作為PCR模板。消化后的上清可于-20°C保存三個(gè)月。

2
PCR擴(kuò)增
2.1 PCR
反應(yīng)體系的配制:
            于低溫環(huán)境下(如冰浴中)完成,以保證PCR擴(kuò)增效率和特異性。

PCR反應(yīng)組分

20 μl反應(yīng)體系

50 μl反應(yīng)體系

模板(消化產(chǎn)物)

2 μl

5 μl

正向引物(10 μM

0.5 μl

1 μl

反向引物(10 μM

0.5 μl

1 μl

2×PCR Easy Mix

10 μl

25 μl

ddH2O

7 μl

18 μl


2.2 PCR反應(yīng)條件:

溫度(°C

時(shí)間

循環(huán)數(shù)

94

5 min

1

94

20 sec

 
35-40

50-65

30 sec

72

X min (1kb/min)

72

5 min

1

4

--

1


3、瓊脂糖凝膠電泳
           試劑中含有溴酚藍(lán)染料,PCR產(chǎn)物可以直接點(diǎn)樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。另外PCR產(chǎn)物的3’端帶有堿基A,可直接克隆至T載體,用于DNA測(cè)序。
 
常見(jiàn)問(wèn)題及對(duì)策分析

常見(jiàn)問(wèn)題

可能原因

對(duì)策

樣本組與陽(yáng)性對(duì)照組均無(wú)擴(kuò)增條帶

PCR反應(yīng)條件設(shè)置不當(dāng)

優(yōu)化PCR反應(yīng)條件

PCR引物質(zhì)量問(wèn)題

重新設(shè)計(jì)PCR引物

樣本組無(wú)擴(kuò)增條帶而陽(yáng)性對(duì)照組正常

不當(dāng)儲(chǔ)存或長(zhǎng)期儲(chǔ)存引起試劑活性喪失

使用新鮮的試劑

組織消化不夠充分

延長(zhǎng)55°C消化時(shí)間至60min

蛋白酶未被完全滅活

消化產(chǎn)物在95°C孵育5min

存在非特異性擴(kuò)增條帶

PCR退火溫度太低,循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度太高

增加PCR退火溫度,降低PCR循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度

PCR引物錯(cuò)配

重新設(shè)計(jì)PCR引物

配制PCR反應(yīng)體系時(shí)溫度太高或配制完成后放置時(shí)間太久

PCR反應(yīng)體系的配制在低溫下進(jìn)行,配制完成后請(qǐng)盡快進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)



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