兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的分離培養(yǎng)

【簡介】

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，對骨髓中的造血干細(xì)胞（HSC）不僅有機(jī)械支持作用，還能分泌多種生長因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）來支持造血。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潛能，能促進(jìn)間充質(zhì)組織的再生，如：骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪及基質(zhì)等組織;

【材料】

超凈臺、PBS、廢液桶、75%酒精、手術(shù)包、percoll分離液、培養(yǎng)基、培養(yǎng)瓶等；

【方法】

1）兔處死后, 放入75% 的酒精內(nèi)浸泡15 min，無菌條件下取出雙側(cè)股骨、脛骨、肱骨，去除附帶組織,浸入生理鹽水中清洗2次；

2）鑷子和剪刀分離出股骨和脛骨，剔除骨頭表面肌肉，PBS溶液沖洗兩遍，酒精棉布擦拭，清理干凈外骨骼，移入6cm培養(yǎng)皿；

3）培養(yǎng)液浸泡，剪掉頭尾，露出骨髓腔用無菌注射器抽取含10%FBS的L-DMEM針頭刺穿沖洗骨髓腔；

4）用培養(yǎng)液進(jìn)行反復(fù)吹打，制備骨髓單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管，1000?r/min離心3min，棄上清、脂肪層，重復(fù)離心1次；

5）細(xì)胞沉淀加入4ml含10%FBS的L-DMEM重懸細(xì)胞，使用Percoll梯度分離；

注：Percoll調(diào)整為1.073濃度，4ml細(xì)胞懸液加入含5ml分離液的離心管；

6）2000RPM/20min，取中間渾濁單核細(xì)胞層，PBS兩倍稀釋后懸液1000RPM/3min，棄上清，10%FBS的L-DMEM重懸細(xì)胞，移入10cm Dish，37°、5%CO₂培養(yǎng)；

7）24h后換液（視細(xì)胞貼壁情況），之后3天換一次液；

【培養(yǎng)】

干細(xì)胞專用培養(yǎng)液

【鑒定】

四、鑒定

1）流式細(xì)胞鑒定：

陽性：CD29、CD90、CD44、CD105、CD166;

陰性：CD34、CD45、CD80、CD86;