原理

HE 染色主要使用蘇木精和伊紅這兩種染液，其中蘇木精堿性染液為藍(lán)色，可以將組織的酸性結(jié)構(gòu)染成藍(lán)紫色（細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色；軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍(lán)；粘液呈灰藍(lán)）；伊紅是一種化學(xué)合成的酸性染料，在水中解離成帶負(fù)電荷的陰離子，易于蛋白質(zhì)氨基中的正電荷結(jié)合使細(xì)胞漿染色。

細(xì)胞漿、肌肉、結(jié)締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色。

材料與儀器

小鼠、固定液、酒精、二甲苯、石蠟、蜂蠟

蘇木精染液、伊紅酒精溶液、鹽酸酒精溶液

甘油蛋白粘片劑、中性樹膠

石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)、恒溫箱、蠟杯

酒精燈、解剖剪、培養(yǎng)皿、鑷子、單面刀片

染色缸、蓋玻片、載玻片、玻片盤、顯微鏡

溫度計、水浴鍋

步驟

一、制作卵巢石蠟切片

1、取材

小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）進(jìn)行麻醉，頸椎脫臼法處死小鼠，取出雙側(cè)卵巢。取下所需組織，切成一小塊 3~4 mm 厚。

2、固定、洗滌、脫水

（1）將切好的卵巢組織用生理鹽水洗一下，使用中性福爾馬林固定液固定 30~50 min。后用流水沖洗 3 次，每次 5 min。

（2）卵巢組織依次經(jīng) 70%、80%、90% 乙醇溶液脫水，各 30 min。

（3）再放入 95%、100% 乙醇溶液各 2 次，每次 20 min。

3、透明、透蠟

（1）使用純酒精、二甲苯等量混合液處理組織 15 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各 15 min 至透明。

（2）放入二甲苯和石蠟等量混合液處理 15 min，再放入石蠟Ⅰ、Ⅱ透蠟各 50~60 min。透蠟在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行，箱內(nèi)溫度保持在 55~60 ℃ 左右。

4、包埋

（1）用鑷子夾取蠟?zāi)Ｔ诰凭珶羯仙约訜?，并倒入少許從溫箱中取出的純石蠟。

（2）再將鑷子在酒精燈上稍加熱，夾取材料將切面朝下放入蠟?zāi)Ｖ?，排列整齊，再放上包埋盒，輕輕倒入熔蠟。

5、切片、展片、貼片

（1）將包埋好的石蠟塊固定在切片機(jī)上，調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，一般為 4~6 μm。

（2）切下的組織薄片要放到加熱的水中燙平，再貼到載玻片上，放 45 ℃ 恒溫箱中烘干。

二、HE 染色

1、脫蠟、復(fù)水

（1）保持水浴鍋溫度為 60 ℃，將切片放入干燥的染色缸內(nèi)，放入水浴鍋中，30 min 至蠟熔化。

（2）石蠟切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各 5 min，然后放入 100%、95%、90%、80%、70% 各級酒精溶液中各 3~5 min，再放入蒸餾水中 3 min，以便染料可以進(jìn)入組織。

2、染色、脫水

（1）切片放入蘇木精中染色約 10~30 min，用流水沖洗約 15 min，使切片顏色變藍(lán)。

（2）將切片放入 1% 鹽酸乙醇液中褪色，幾秒后見切片變紅、顏色較淺即可，后將切片再放入流水中使其恢復(fù)藍(lán)色。 

（3）切片放入 50%、70%、80% 乙醇中各 3~5 min，用 0.5% 伊紅乙醇液對比染色 1~3 min。

（4）將切片放入 95% 乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無水乙醇中 3~5 min，吸干后將切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各 3~5 min。

3、觀察

在鏡下可見卵巢呈扁橢圓形，表面為單層扁平上皮細(xì)胞或單層立方上皮，卵巢實質(zhì)分為皮質(zhì)和髓質(zhì)?？梢娚掀?，原始卵泡和生長卵泡。卵巢組織中各發(fā)育階段卵泡及卵巢基質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰可見, 細(xì)胞核呈藍(lán)紫色, 細(xì)胞質(zhì)及間質(zhì)成分呈淺紅色, 卵泡中卵母細(xì)胞、卵泡細(xì)胞、透明帶均清晰可見。

注意事項

1. 取材注意事項

（1）取材動作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細(xì)胞的成分、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化。

（2）切片材料應(yīng)根據(jù)需要觀察的部位進(jìn)行選擇，盡可能不要損傷所需要的部分。

（3）切取的組織塊不宜太大，以利于固定劑穿透，通常以 5 mm x 5 mm x 2 mm 或 10 mm x 10 mm x 2 mm 為宜。

2. 固定注意事項

（1）一般固定液，都以新配為好，配好后應(yīng)貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學(xué)變化，失去固定作用。

（2）有些混合固定液的成份之間會發(fā)生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定時就沒有作用了。

（3）固定材料時，固定液必須充足，一般為材料塊的 20~30 倍，有些水分多的材料，中間應(yīng)更換 1~2 次新液。

（4）材料固定完畢后，保存于嚴(yán)密緊塞或加蓋的容器里，同時在容器外上標(biāo)簽，并隨同材料在溶液中投入相應(yīng)的標(biāo)簽，以免相互混淆。標(biāo)簽上注明固定液、材料來源、日期等。標(biāo)簽上的文字，應(yīng)用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。

3. 脫水注意事項

（1）脫水原理：乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟。當(dāng)組織中全部被二甲苯占有時，光線可以透過，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)。

（2）脫水必須在有蓋的玻璃品中進(jìn)行，防止吸收空氣中的水分。

（3）在更換高一級的脫水劑時，最好不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內(nèi)剩余液，然后于皿中加入高一級脫水劑。

（4）在低濃度酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。

（5）在高濃度或純酒精中，每級停留的時間也不宜太長，否則會使組織變脆，影響切片。

（6）如需過夜，應(yīng)停留在 70% 酒精中。

（7）脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象。

4. 透明注意事項

（1）使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進(jìn)入。

（2）更換每級透明劑，動作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕氣。

（3）在透明過程中，如果材料周圍出現(xiàn)白色霧狀，說明材料中的水未被脫凈，應(yīng)退回純酒精中重新脫水，然后再透明，否則切片難以鏡檢。

（4）二甲苯應(yīng)盡量保持無水，應(yīng)經(jīng)常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收水分。

5. 透蠟注意事項

（1）透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內(nèi)部達(dá)到飽和程度以便包埋。透蠟時間根據(jù)組織大小而定。

（2）盡量保持在較低溫度中進(jìn)行，以石蠟不凝固為度。

（3）透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低。

（4）操作要迅速，力求在最短的時間內(nèi)完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等。

（5）注意溫度不要過高，以免組織發(fā)脆。

6. 染色水洗注意事項

（1）染色原理：伊紅主要染細(xì)胞質(zhì)，著色濃淡應(yīng)與蘇木精染細(xì)胞核的濃淡相配合，如果細(xì)胞核染色較濃，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)濃染，以獲得鮮明的對比。

（2）染色時間應(yīng)根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低，適當(dāng)縮短或延長。室溫高時促進(jìn)染色，染色時間可短些，否則可適當(dāng)延長時間，冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。

（3）注意流水不能過大，以防切片脫落。

（4）如果細(xì)胞核染色較淺，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)淡染?？稍谝良t乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細(xì)胞質(zhì)容易著色，并且經(jīng)乙醇脫水時不易褪色。