兔腎小管上皮細(xì)胞原代分離培養(yǎng)
【簡介】
腎小管上皮細(xì)胞是腎小管間質(zhì)的主要細(xì)胞,它具有非常旺盛的代謝活性和潛在的增殖能力,并且能夠分泌多種細(xì)胞因子,所以,腎小管上皮細(xì)胞損傷,是引起急性腎衰竭的直接原因。腎小管上皮細(xì)胞來自于腎立方上皮細(xì)胞,比中性粒細(xì)胞要大,核比較大、呈圓形,核膜較厚,核突出容易見。在尿液中容易變形,大多呈圓形或多邊形,所以又稱多邊細(xì)胞;
【材料】
75%酒精、雙抗PBS、含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液、0.1%Ⅳ型膠原酶、0.05%胰蛋白酶、剪刀、鑷子、培養(yǎng)皿;
【方法】
1)兔處死后75%酒精浸泡3min,開腹腔取腎臟置于預(yù)冷的PBS中,去除外膜,將腎皮質(zhì)剪碎至1mm3大小,洗去血液及尿液;
2)組織沉淀1:3比例加胰酶和Ⅳ型膠原酶混合37°消化20min, 靜置2min取上清,未消化組織加消化液繼續(xù)消化20min,靜置后取上清,重復(fù)至無組織;
3)上清加含血清培液稀釋后經(jīng)100目(150-165um)篩網(wǎng)、200目(70-75um)篩網(wǎng)過濾,收集200目篩網(wǎng)上物,1300R/5min離心后去上清;
4)重懸沉淀600R/3min離心兩次棄上清,純化腎小管;
5)加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)48h首次換液,后面2d換液一次;
【培養(yǎng)】
上皮專用培養(yǎng)液
【鑒定】
陽性:細(xì)胞角蛋白18(Cytokeratin 18)、ZO-1、腎小管上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白Villin、AQP1和SGLT2,采用細(xì)胞角蛋白18(Cytokeratin 18);
陰性:波形蛋白Vimentin;