小鼠甲狀腺細胞分離培養(yǎng)及鑒定

【簡介】

甲狀腺是脊椎動物非常重要的腺體，屬于內(nèi)分泌器官，位于哺乳動物頸部甲狀軟

骨下方，氣管兩旁;其中，甲狀腺上皮細胞 ( 也稱為濾泡細胞或主要細胞 ) 在甲狀腺細胞中是負責(zé)生產(chǎn)和分泌甲狀腺激素，包括四碘甲狀腺原氨酸 (T4) 和三碘甲腺原氨酸 (T3)，具有 調(diào)節(jié)動物體生長發(fā)育、基礎(chǔ)代謝及繁殖活動的重要生理功能；

【材料】

一）器械滅菌：

手術(shù)器械： 2把眼科直剪，2把彎鑷、2支左右1.5mL離心管、6cm或10cm Dish；

二）溶液準(zhǔn)備：

1）DMEM/F12 （含有20%FBS）培養(yǎng)基，37度水浴溫育；

2）雙抗PBS、75%的酒精；

3）II型膠原酶、I型膠原酶、中性蛋白酶、胰酶

【方法】

1、取 6-8 周齡的雄性小鼠，處死小鼠，，75％的酒精,取出與氣管相連的甲狀腺組織，置于預(yù)冷無菌含雙抗的PBS緩沖液中浸泡洗滌，并剝離甲狀腺組織；

2、在冰上用解剖剪機械剪碎甲狀腺組織，大小約1mm³左右的碎塊；

3、將剪碎的組織加入預(yù)熱的 4-5 倍體積的消化混合液，于 37℃震蕩消化 30-40min，震蕩頻率為250-300次/min；所述消化混合液包括0.05％-0.1％ 胰酶、0.1％-0.2％I型膠原酶、0.05％-0.15％II型膠原酶和 1-2U/mL中性蛋白酶；

4、吹打使細胞分散，經(jīng) 200 目篩網(wǎng)過濾后，加入至含 Ficoll的分離液中，2000rpm/min離心，取中間白色層，1500rpm/min離心5min，棄上清；

5、PBS清洗2次，細胞種盤;

【培養(yǎng)】

DMEM（20%FBS）或干細胞專用培養(yǎng)液

【鑒定】

1）免疫熒光：

陽性：Cytokeratin-18；