1、 取新鮮抗凝全血(EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝血均可)或者去纖維蛋白血液,用等體積的全血及組織稀釋液或者PBS稀釋全血。
2、 取一支無菌離心管,先加入試劑A,再加入試劑D,使兩者形成梯度界面(試劑A:試劑D的體積比為3:2,如稀釋后的血液樣本小于5ml,則先后加入3ml試劑A和2ml試劑D;如稀釋后的血液樣本大于5ml,試劑總量與稀釋后的血液樣本量相等),兩種試劑的分層一定要清晰。
3、 將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方,注意保持兩液面界面清晰。(可以使用巴氏德吸管吸取血液,然后將血液小心的平鋪于分離液上,因?yàn)閮烧叩拿芏炔町悾瑢⑿纬擅黠@的分層界面。如果樣品較多,加樣的時間較長,在離心之前出現(xiàn)紅細(xì)胞成團(tuán)下沉屬正?,F(xiàn)象)
4、 室溫,水平轉(zhuǎn)子500~800g,離心20~30min(血液的體積越大所需的離心力越大,離心時間越長,最佳的分離條件需自行摸索,離心轉(zhuǎn)速最大不超過1000g)。
5、 離心后將出現(xiàn)明顯的分層: 第一層為血漿層;第二層為白色單核細(xì)胞層;第三層為透明試劑D液層;第四層為半透明試劑A液層;第五層為紅細(xì)胞層(如圖示)。
6、 小心吸取第二層白色單核細(xì)胞層到另一無菌的15ml離心管中,加入10mL細(xì)胞洗滌液或PBS,顛倒混勻,250g,離心10min。
7、 棄上清,5mL的細(xì)胞清洗液或PBS重懸細(xì)胞,250g,離心10min。
8、 重復(fù)步驟7
9、 棄上清,細(xì)胞重懸備用。
10、 差異貼壁法純化細(xì)胞:用單核細(xì)胞培養(yǎng)基以106個/ml的密度重懸細(xì)胞,將細(xì)胞鋪于細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
1) 2~4 h內(nèi)貼壁的為單核細(xì)胞。
2) 10~24 h內(nèi)貼壁的單個核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞 。
3) 不貼壁的為淋巴細(xì)胞。