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實(shí)驗(yàn)技巧—細(xì)胞培養(yǎng)重難點(diǎn)

上海東寰和您一起整理關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)重難點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)技巧—細(xì)胞培養(yǎng)重難點(diǎn)

一.細(xì)胞復(fù)蘇


1、提前準(zhǔn)備完全培養(yǎng)基并預(yù)熱至37℃(可以放至在水浴或培養(yǎng)箱中進(jìn)行預(yù)熱,需要多少預(yù)熱多少,反復(fù)預(yù)熱會導(dǎo)致培養(yǎng)基失活);用清洗潔凈的燒杯或其他合適容器裝有適量超純水,然后放入37-38℃水浴鍋中預(yù)熱至37℃(至少需30min);把所需耗材和其他物品放置于超凈工作臺中紫外照射滅菌;


2、提前查詢所取凍存管的存放位置,把整個(gè)存儲架子提起,為了降低復(fù)溫對其它細(xì)胞的影響,可把該存儲架子放置于裝有液氮的泡沫盒中,快速(存儲架離開液氮罐的時(shí)間不要超過1分鐘,否則其余細(xì)胞容易復(fù)溫死亡,凍存管子的液氮會氣化爆炸)從液氮罐中取出凍存管并放置于裝有液氮的保溫杯中(必須用用潔凈鑷子取出凍存管,以免凍傷手),立即把存儲架回液氮罐;用鑷子把剛才置于保溫杯的凍存管取出,并立即(不要耽擱)放入上述準(zhǔn)備好的水浴中(放入之前快速檢查蓋子是否擰緊,蓋子切勿沒入水中,以免進(jìn)水污染),用鑷子鑷好凍存管,快速沿著容器內(nèi)壁轉(zhuǎn)圈,細(xì)胞未凍融時(shí)(1min內(nèi))切勿取出觀察,細(xì)胞凍融時(shí)間一般為1-2 min,如果超過2min仍未凍融,應(yīng)棄用該管細(xì)胞,凍融后立即用70%酒精消毒該凍存管,然后立即放入超凈工作臺中;


3、打開凍存管蓋,用移液管吹打細(xì)胞3次,然后立即把細(xì)胞轉(zhuǎn)移至提前準(zhǔn)備的裝有5-10ml預(yù)熱的完全培養(yǎng)基的15ml離心管中;


4、離心,小心移除上清;


5、加入5ml預(yù)熱完全培養(yǎng)基,吹打重懸細(xì)胞,然后把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中,并放入二氧化碳培養(yǎng)箱(5% CO2, 37℃)中培養(yǎng);


6、第二天觀察細(xì)胞的貼壁情況,并進(jìn)行換液。


注意事項(xiàng)

  1. 細(xì)胞復(fù)蘇操作要求快速,否則細(xì)胞容易在凍融過程中產(chǎn)生冰晶,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡,所以必須提前準(zhǔn)備好所需的培養(yǎng)基、培養(yǎng)耗材和其他所需物品,絕對不允許臨時(shí)準(zhǔn)備;

2.在解凍細(xì)胞前,必須把超凈工作臺準(zhǔn)備至工作狀態(tài),提前準(zhǔn)備裝有5-10ml預(yù)熱的完全培養(yǎng)基的15ml離心管;


3.為了降低復(fù)溫對其它細(xì)胞的影響,可把該存儲架子放置于裝有液氮的泡沫盒中;


4.存儲架離開液氮罐的時(shí)間一般不要超過1分鐘,否則其余細(xì)胞容易復(fù)溫死亡,凍存管子的液氮?dú)饣ǎ?/span>


5.放入之前快速檢查蓋子是否擰緊,蓋子切勿沒入水中,以免進(jìn)水污染;


6.細(xì)胞未凍融時(shí)(1min內(nèi))切勿取出觀察;


7.根據(jù)復(fù)蘇細(xì)胞的大小選擇合適的離心速度和時(shí)間,一般不超過1000RPM,10min;


8.復(fù)蘇后的第二天必須要進(jìn)行換液(加入培養(yǎng)基的量根據(jù)細(xì)胞的密度和生長速度),以降低凍存保護(hù)劑DMSO的影響;


9.離心速度和時(shí)間依據(jù)具體細(xì)胞決定;


10.上述是以T25培養(yǎng)瓶為例,具體選用何種培養(yǎng)器皿取決于細(xì)胞生長密度需求(啟動正常生長所需的密度)。

二.細(xì)胞換液培養(yǎng)


1、全量換液:把所有的舊培養(yǎng)液移除,加入新的培養(yǎng)液(加入培養(yǎng)基的量根據(jù)細(xì)胞的密度和生長速度);


2、半量換液:把舊培養(yǎng)液移至15ml離心管中,然后在培養(yǎng)器皿中加入適量新培養(yǎng)基(避免細(xì)胞離開培養(yǎng)液太久),把裝有舊培養(yǎng)液的離心管進(jìn)行離心(1000RPM, 10min),離心后取適量舊培養(yǎng)上清至培養(yǎng)器皿中。


注意事項(xiàng)

1.全量換液適合于生長較快的腫瘤細(xì)胞,因?yàn)檫@些細(xì)胞可在短期內(nèi)分泌足夠的因子來支撐其生長;


2.半量換液主要適合于生長較慢的原代細(xì)胞和干細(xì)胞,這些細(xì)胞很難在短期內(nèi)分泌足夠的因子來支撐其生長,舊培養(yǎng)液中恰好含有這些因子;


3.新舊培養(yǎng)液的配比取決于細(xì)胞的密度和生長速度及其自身的特性,請參照具體細(xì)胞的培養(yǎng)建議,一般為3:1(新:舊);


4.如果細(xì)胞發(fā)生發(fā)生污染,切勿進(jìn)行半量換液。

三.細(xì)胞傳代培養(yǎng)


1、當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到其生長密度極限時(shí)(一般腫瘤細(xì)胞為80-100%,原代細(xì)胞和干細(xì)胞為80-90%,有些細(xì)胞為40-50%,熟知所養(yǎng)細(xì)胞的生長密度極限),移除舊培養(yǎng)液;


2、用PBS洗滌兩次(舊培養(yǎng)中的鈣離子會抑制胰酶的活性),加入1ml胰酶消化液(以T25培養(yǎng)瓶為例),立即蓋好蓋子,把培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察,如大部分細(xì)胞變圓,立即移除胰酶消化液(如大部分細(xì)胞漂起,可不移除胰酶消化液),加入5ml預(yù)熱完全培養(yǎng)基,用吸管取培養(yǎng)液吹打瓶壁細(xì)胞,使其脫離瓶壁形成單細(xì)胞懸液,離心,小心移除上清;


3、加入5ml預(yù)熱完全培養(yǎng)基,吹打重懸細(xì)胞用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞數(shù),分裝入T25培養(yǎng)瓶中,添加基至總體積為5ml,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);傳代1次。


注意事項(xiàng)

1.熟知所養(yǎng)細(xì)胞的生長密度極限;


2.第一次進(jìn)行所養(yǎng)細(xì)胞傳代時(shí),消化時(shí)必須把培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察,并記錄所需時(shí)間,下次按照該時(shí)間執(zhí)行即可;


3.進(jìn)行細(xì)胞傳代時(shí)必須結(jié)合考慮細(xì)胞生長密度需求(啟動正常生長所需的密度)和實(shí)際的工作需求,在滿足細(xì)胞生長密度需求的前提下,需要多少瓶就傳多少瓶,降低工作強(qiáng)度和試劑耗材消耗;


4.離心速度和時(shí)間依據(jù)具體細(xì)胞決定。

四.細(xì)胞凍存保種


1、提前配制凍存液:用血清或完全培養(yǎng)基配制5-10%DMSO(根據(jù)具體細(xì)胞決定)凍存液;


2、消化收取細(xì)胞:當(dāng)細(xì)胞密度即將達(dá)到其生長密度極限時(shí)進(jìn)行換液,第二天,移除舊培養(yǎng)液,用PBS洗滌兩次(舊培養(yǎng)中的鈣離子會抑制胰酶的活性),加入1ml胰酶消化液(以T25培養(yǎng)瓶為例),立即蓋好蓋子,把培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察,如大部分細(xì)胞變圓,立即移除胰酶消化液(如大部分細(xì)胞飄起,可不移除胰酶消化液),加入5ml預(yù)熱完全培養(yǎng)基,用吸管取培養(yǎng)液吹打瓶壁細(xì)胞,使其脫離瓶壁形成單細(xì)胞懸液,離心,小心移除上清;


3、加入適量(消化前預(yù)估細(xì)胞的數(shù)量,1-2*10E6/ml凍存液)凍存液并吹打混勻,分裝至凍存管中,標(biāo)記凍存細(xì)胞的名稱、冷凍日期、操作者姓名拼音簡寫,然后放入梯度降溫盒(提前復(fù)溫至室溫),置于-80℃過夜,次晨置于液氮罐中保存。


注意事項(xiàng)

1.密切觀察細(xì)胞的生長密度,當(dāng)細(xì)胞密度即將達(dá)到其生長密度極限時(shí)進(jìn)行換液,以便第二天進(jìn)行保種;


2.消化前進(jìn)行凍存液配制,切勿用培養(yǎng)基和血清重懸細(xì)胞后再加入DMSO,這樣會導(dǎo)致局部高濃度的DMSO對細(xì)胞產(chǎn)生損傷;


3.消化前預(yù)估細(xì)胞的數(shù)量,加入適量凍存液,以使細(xì)胞密度為1-2*10E6/ml,密度過高會導(dǎo)致凍存保護(hù)液不足,密度過低會導(dǎo)致凍存液對細(xì)胞有毒性;


4.梯度降溫盒必須提前復(fù)溫至室溫,切勿從-80℃取出即可使用,這樣會導(dǎo)致細(xì)胞全部死亡;


5.離心速度和時(shí)間依據(jù)具體細(xì)胞決定。

問答環(huán)節(jié)


細(xì)胞體內(nèi)外培養(yǎng)的差別是什么?

答:細(xì)胞離體后,失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的相互影響,生活在缺乏動態(tài)平衡相對穩(wěn)定環(huán)境中,日久天長,易發(fā)生如下變化:分化現(xiàn)象減弱;形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時(shí)間后衰退死亡;或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性,變成可無限生長的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。因此,培養(yǎng)中的細(xì)胞可視為一種在特定的條件下的細(xì)胞群體,它們既保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能,也有一些不同于體內(nèi)細(xì)胞的性狀。實(shí)際上從細(xì)胞一旦被置于體外培養(yǎng)后,這種差異就開始發(fā)生了。

什么是無血清培養(yǎng)基?與普通培養(yǎng)基有什么區(qū)別?

答:無血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分?;境煞譃榛A(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。添加組分可能包括纖連蛋白、層粘連蛋白等貼壁因子、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒等。

細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍,可否繼續(xù)使用?

答:如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍,您應(yīng)該自然溶解培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生,培養(yǎng)基可以正常使用,如果出現(xiàn)沉淀,只能丟棄這些培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復(fù)凍融嗎?

答:大部分添加物和試劑最多可以凍融3次,如果次數(shù)過多會將使含有的蛋發(fā)生降解和沉淀,這將會影響它的性能。

液體培養(yǎng)基的保存是冷藏好?還是冷凍好?

答:要冷藏??!通常液體培養(yǎng)基在冷藏條件下可存放6個(gè)月到一年。

低血清培養(yǎng)基能用肉眼判斷其pH值嗎?

答:低血清培養(yǎng)基中酚紅的含量與普通培養(yǎng)基中的酚紅含量不同,不能通過肉眼觀察或通過經(jīng)驗(yàn)來判定pH值,建議使用pH計(jì)進(jìn)行測定。