血管生長是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵步驟。無論原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性腫瘤,一旦生長直徑超過1~2mm,都會有血管生成,這是由于腫瘤細(xì)胞自身可分泌多種生長因子,誘導(dǎo)血管生成。
由于腫瘤組織這種新生血管結(jié)構(gòu)及功能異常,且血管基質(zhì)不完善,這種 微血管容易發(fā)生滲漏,因此腫瘤細(xì)胞不需經(jīng)過復(fù)雜的侵襲過程而直接穿透到血管內(nèi)進(jìn)入血流并在遠(yuǎn)隔部位形成轉(zhuǎn)移。越來越多的研究表明,良性腫瘤血管生成稀少,血管生長緩慢;而大多數(shù)惡性腫瘤的血管生成密集且生長迅速,因此,血管生成在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用,抑制這一過程將能明顯阻止腫瘤組織的發(fā)展和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。
血管生成實驗的技術(shù)原理主要是應(yīng)用Matrigel模擬機(jī)體環(huán)境,上面接種腫瘤細(xì)胞,觀察血管生成情況。
體外的血管生成實驗?zāi)芎芎玫哪M腫瘤的血管發(fā)生過程,并且適合研究藥物對這一過程的影響實驗。我們以HUVEC細(xì)胞為例,介紹這一實驗的詳細(xì)過程。
1、主要步驟
Step1:細(xì)胞培養(yǎng)
Step2:細(xì)胞轉(zhuǎn)染或藥物處理
Step3:鋪Matrigel膠
Step4:接種細(xì)胞
Step5:觀察血管生成情況
實驗過程中需要注意:
1、實驗前一天需要將Matrigel置于冰盒,放入冰箱中,同時需要準(zhǔn)備一些預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel膠;
2、將Matrigel膠加到血管生成載玻片時注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel,防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠;
3、需要按照細(xì)胞的生長速度定時采集圖像,并且對其成管長度、覆蓋面積、成環(huán)數(shù)和結(jié)點進(jìn)行測量和記錄,并且對其進(jìn)行統(tǒng)計分析;
4、分上下孔的ibidi血管生成載玻片能去除凹液面,使成像效果更好。
(Matrigel鋪在下孔,細(xì)胞鋪在Matrigel上,上孔充滿培養(yǎng)基)
2、數(shù)據(jù)分析
(在特定的時間點采集圖片,并且進(jìn)行圖像分析(Wimasis全自動分析)測量小管長度,成環(huán)數(shù),細(xì)胞覆蓋面積和結(jié)點。之后在對測量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析以說明實驗結(jié)果。)
三、實驗具體步驟
1、準(zhǔn)備基質(zhì)膠
1)實驗前一天將Matrigel置于冰盒中,放入4度冰箱,使膠能過夜緩慢融化。(注意:同樣要準(zhǔn)備一些4攝氏度預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel)。
2)開始實驗前,將Matrigel始終保持放在冰盒中。
3)打開滅菌包裝,取出ibidi血管生成載玻片。
4)每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel,防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。 由于Matrigel流動性不強(qiáng),并且有可能移液槍不準(zhǔn)確,有可能打入10μl的膠,卻不能填滿血管生成載玻片的下孔——這樣,必然會影響到實驗的成像結(jié)果。
如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel:
我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。
如上圖所示,垂直透過每個孔看下面的格子紙,如果格子被縮小了,那么就說明膠沒加滿,格子被放大了,那么膠就加多了,格子沒發(fā)生什么變形,這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。
2、凝膠
1)蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
2)準(zhǔn)備一個10cm的培養(yǎng)皿,放入浸過水的紙巾,制成一個濕盒。
3)將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中,蓋上培養(yǎng)皿蓋。
4)將整個培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中,靜置30分鐘左右,等待膠凝結(jié)。
5)等待同時準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。
3. 鋪細(xì)胞
加入細(xì)胞的量直接影響實驗結(jié)果,所以在正式實驗開始之前,要對不同類型的細(xì)胞和使用數(shù)量進(jìn)行預(yù)實驗。獲得最佳比例的細(xì)胞密度。我們今天的實驗使用HUVEC細(xì)胞,每孔種10000個細(xì)胞即可。
1) 準(zhǔn)備密度為2×105的細(xì)胞懸液,充分混勻。
2)將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
3)每孔加入50μl的細(xì)胞懸液,注意保持槍頭垂直在上孔的上方,不要接觸下孔的凝膠??梢允褂门艠尅?nbsp;
4)同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體,如果沒有,加入無細(xì)胞的培養(yǎng)基,使上孔液體正好加滿。
5)蓋上蓋,靜置,一段時間后,所有細(xì)胞都會沉下去落在Matrigel的表面。
4、采集圖像并統(tǒng)計結(jié)果
可以按照細(xì)胞的生長速度定時采集圖像,并且對其成管長度,覆蓋面積,成環(huán)數(shù),結(jié)點數(shù)進(jìn)行測量和記錄,并且對其進(jìn)行統(tǒng)計分析。
5、免疫熒光染色
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