實驗樣本分類

實驗一般采取樣本有：血液樣本、組織樣本和細(xì)胞樣本。

通常，組織樣本采集后，應(yīng)立即用等滲溶液（PBS或生理鹽水）盡量把血液漂洗干凈（除非血液也是分析對象），用濾紙或紗布吸干，把樣本分切成幾分，每份的體積約2個黃豆大小，每份用一個管子裝。

血液樣本的采集應(yīng)根據(jù)不同實驗的要求，將會采取不同策略。

血清樣本：全血中不加抗凝劑，血液凝固后取出的不含凝血因子的淡黃色透明液體。（全血標(biāo)本室溫放置2小時3000rpm/min離心15min）

血漿樣本：全血中加抗凝劑，血液凝固后取出的含凝血因子的淡黃色透明液體。（可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8℃，3000rpm/min離心15min）

• 如果是做生化\ELISA等檢測可以考慮血漿和血清，根據(jù)獲得的樣本量可考慮分裝成100-500μl/管，可避免反復(fù)凍融造成的檢測誤差。

生化：建議優(yōu)先選擇血清，其次選擇肝素抗凝血漿；

ELISA：建議優(yōu)先選擇血清，其次選擇肝素或EDTA抗凝血漿；

凝血實驗：只能選擇枸櫞酸鈉抗凝血漿；

血常規(guī)：只能選擇EDTA抗凝全血；

• 如果要收集其中的白細(xì)胞、血小板等建議用抗凝全血。
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• 如果要做流式建議用專門的流式用血液收集管，防止表面抗原的丟失，或者盡快安排就近檢測。

樣本處理

取樣完后，應(yīng)根據(jù)所檢測指標(biāo)的要求，需采取不同策略處理。

在如今分子生物學(xué)當(dāng)?shù)赖默F(xiàn)實背景下，動物實驗除了對實驗動物的體征及生理指標(biāo)進(jìn)行全方位的監(jiān)控外，各種分子檢測甚至是組學(xué)檢測也開始大行其道，動物實驗結(jié)束之后的機制研究成為了實驗的重頭戲。

一般來說，動物實驗檢測對象主要包括：

（1）體液中各類因子定性及定量檢測

由于此類檢測對象多為蛋白及各類小分子物質(zhì)，因此在取樣過程中應(yīng)注意防止此類物質(zhì)降解，在獲取后，應(yīng)及時置于超低溫（≤-80℃）進(jìn)行保存，在后續(xù)實驗過程中，也應(yīng)當(dāng)注意保存條件的穩(wěn)定性，避免反復(fù)凍融。

最常用的方法便是酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA），除此之外，可利用生化分析儀及不同檢測方法的試劑盒（比色法、比濁法等）方法對各類生化指標(biāo)及因子進(jìn)行定性及定量檢測。

（2）組織器官病理、生理變化及免疫組化檢測

常用的病理檢測多使用H&E染色對細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核進(jìn)行染色標(biāo)記，以觀察細(xì)胞變化。除此之外，許多特殊染色也在病理生理變化中得到了廣泛應(yīng)用，如利用Masson染色檢測組織纖維化病變，Nissl染色檢測神經(jīng)元損傷，β-半乳糖甘酶染色檢測細(xì)胞衰老等。

此外，還可以通過免疫組化技術(shù)對某些特異性標(biāo)記物進(jìn)行免疫顯色檢測，達(dá)到原位定性或定量檢測的目的。

（3）基因/蛋白質(zhì)表達(dá)定性或定量檢測

在進(jìn)行分子檢測的過程中，保持核酸和蛋白質(zhì)的完整性至關(guān)重要，因此在取樣過程中，應(yīng)盡量避免核酸及蛋白質(zhì)的降解。如不注意采樣過程，將會導(dǎo)致樣本中的核酸及蛋白質(zhì)的無差別降解，嚴(yán)重影響后續(xù)分子檢測結(jié)果。

• 在條件允許的情況下，組織樣本在離體后應(yīng)立刻裝入凍存管內(nèi)，并立即放入液氮中進(jìn)行冷凍。
• 在RNA提取樣本的保存過程中，可以選擇非冷凍型RNA保存液或Trizol試劑進(jìn)行RNA酶的抑制。
• 針對蛋白質(zhì)提取樣本的保存，我們同樣可以使用商品化的蛋白酶抑制劑進(jìn)行短期處理。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）及免疫印跡（Western blotting，WB），這兩種實驗手段是分子生物學(xué)檢測中不可或缺的一部分，也是發(fā)表論文至關(guān)重要的分子檢測數(shù)據(jù)。PCR主要用來對基因在基因組層面或轉(zhuǎn)錄層面的變化進(jìn)行定性或定量檢測，而WB則主要用來對某一蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行定量檢測。

（4）轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)檢測

隨著檢測水平及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，各類組學(xué)檢測的價格大大降低，實驗設(shè)計中也常常運用組學(xué)檢測來提升實驗設(shè)計的檔次。在我們進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測過程中，同樣是要首先確保目標(biāo)RNA或蛋白質(zhì)的片段完整性。

代謝組學(xué)的研究對象大都是相對分子量在1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)，因此常用的血液樣本在取樣后，應(yīng)小心操作，防止溶血，盡快分離出血清，分置于超低溫環(huán)境下保存。

由于用于病理實驗的動物組織采集相對其他樣品的采集，操作更繁瑣，在處理過程中許多細(xì)節(jié)容易忽略，造成數(shù)據(jù)不完美（甚至不能用）。因此接下來將重點介紹組織樣品采集的注意事項及其固定。

組織樣品采集注意事項

1. 組織應(yīng)新鮮，操作時間盡可能短，否則細(xì)胞發(fā)生死后變化、自融及腐敗現(xiàn)象。最好是動物心臟還在跳動時采集，樣本取出后最好在5分鐘以內(nèi)置于固定液內(nèi)，避免長時間暴露在空氣環(huán)境中。
2. 組織塊盡量小而薄。組織塊的厚度以不超過5mm為宜，較為理想的厚度為2mm左右，主要目的是使固定液迅速而均勻的滲入組織塊內(nèi)部。
3. 勿使組織塊受擠壓。在采集過程中，應(yīng)盡量選擇較為鋒利的手術(shù)器械，如手術(shù)專用刀片等，避免操作過程中擠壓挫傷標(biāo)本。擠壓過的組織均不可用。固定液的量一般以組織塊大小的20倍為宜，組織能夠在容器內(nèi)自由移動最佳。
4. 盡量保持組織的原有形態(tài)。新鮮組織經(jīng)固定后，或多或少產(chǎn)生收縮現(xiàn)象（如胃腸），為此可將組織展平，以盡可能維持原形。
5. 保持組織清潔。組織塊上如有血液、污物、粘液、食物、糞便等，可用生理鹽水沖洗，然后再入固定液，但要注意防止組織損傷。
6. 要熟悉采集部位。要能準(zhǔn)確的按解剖部位采集，如胰腺，一般取胰島較多的胰腺尾部；肺應(yīng)取有細(xì)支氣管及帶有軟骨片的小支氣管部。如果實驗需進(jìn)行多組織樣本的采集，采集順序應(yīng)按照：消化器官，神經(jīng)系統(tǒng)器官，皮膚，肌肉等的順序進(jìn)行。
7. 選好組織塊的切面。熟悉某些器官組織成分安排，然后決定其切面的走向；如一長管狀器官以橫切面較好。
8. 切除不需要的部分。特別是組織周圍的脂肪等，應(yīng)盡可能清除掉，否則給固定、脫水、浸蠟、切片等帶來一些不必要的問題。

組織樣品的固定

（1）固定的方法：

①小塊組織固定法：從動物取下的小塊組織，立即置入液態(tài)固定劑（這是應(yīng)用最廣泛最經(jīng)常的方法）。

②注射/灌注固定法：某些組織塊由于體積過大或固定液極難滲入內(nèi)部或需要對整個臟器或整個動物進(jìn)行固定，這時宜采用注射固定法，將固定液注入血管，經(jīng)血管分支到達(dá)整個組織和全身，從而得到充分的固定。

另，空腔組織比如肺，肺內(nèi)含有空氣，固定液難以滲入，建議先做肺灌注，使得肺充盈滿固定液以后再進(jìn)行保存，如果空腔中氣體沒有有效排出，后續(xù)可能影響固定效果（沒有灌注的肺組織會浮在液體表面不利于固定，切片以后也會看到很多的空泡）。

③蒸汽固定法：比較細(xì)小而薄的標(biāo)本，可用鋨酸或甲醛蒸汽固定。主要用于血液或細(xì)胞涂片以及某些薄膜組織的固定。

（2）固定的目的

①保持其原有狀態(tài)：使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，迅速防止組織、細(xì)胞的死后變化，防止自溶與腐敗，防止細(xì)胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)，使之盡量保持生前的狀態(tài)和結(jié)構(gòu)。

②以便染色后易于鑒別和觀察：不同組織成分對染料有不同的親和力，以便染色后易于鑒別和觀察。

③使組織塊硬化，便于制作薄片（組織塊在脫水、包埋、切片、染色等過程中不易損壞）。

（3）固定液

固定液種類：一類是單純固定液，即只有一種試劑；另一類是混合固定液，由兩種或兩種以上試劑組成。

作為較好的固定液，應(yīng)有下列特性，首先，有強滲透力，能迅速的滲入組織內(nèi)部；其次，不使組織過度收縮或膨脹，并能使組織內(nèi)欲觀察的成分得以凝固為不溶性物質(zhì)；最后，能使組織達(dá)到一定的硬度并獲得較佳的折光率和對某些染料具有較強的親和力。

固定液通常使用10%的甲醛溶液。特殊要求的組織，常需要特殊的固定液，取樣之前應(yīng)做好準(zhǔn)備。如眼球樣本應(yīng)使用FAS眼球固定液，脂肪組織應(yīng)使用脂肪組織專用固定液等。此外，在進(jìn)行骨組織樣本制備的時候，還應(yīng)注意提前進(jìn)行脫鈣處理，可根據(jù)具體情況選擇慢脫鈣或快脫鈣處理。

總的來說，樣品的采集是實驗中至關(guān)重要的一環(huán)，如果取樣環(huán)節(jié)出現(xiàn)了偏差，往往會導(dǎo)致后續(xù)檢測結(jié)果的偏移，稍有不慎便前功盡棄。而清晰把握了不同檢測實驗的檢測對象，并根據(jù)其特性采取不同的采樣策略，搭配各種輔助工具及試劑，往往能夠事半功倍，輕松完成實驗。

最后，在采樣過程中，應(yīng)據(jù)實驗動物福利倫理，在實驗過程中盡量減少動物的痛苦，盡最大努力善待它們。