Annexin V/PI 流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑

產(chǎn)品簡(jiǎn)介
        細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的基本特征，它在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和一些疾病發(fā)生過程等方面起著十分重要的作用。Annexin V 是檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡的*靈敏指標(biāo)之一。正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸 (PS)只分布在細(xì)胞膜磷脂雙分子層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸發(fā)生外翻，暴露于細(xì)胞質(zhì)膜的外側(cè)。在體內(nèi)，巨噬細(xì)胞可以識(shí)別翻轉(zhuǎn)的 PS，從而將這些程序性細(xì)胞凋亡的細(xì)胞**，因此凋亡過程中并不伴隨局部的炎癥反應(yīng)。Annexin V 是一種分子量為35-36kD 的與磷脂酰絲氨酸有高度親和力的 Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，因此能夠利用 Annexin V 與細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸相結(jié)合的性質(zhì)，檢測(cè)細(xì)胞的早期凋亡。將 Annexin V 進(jìn)行綠色熒光 (FITC) 標(biāo)記，以標(biāo)記了的 Annexin V-FITC 作為探針， 利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶 (PI)是一種核酸染料，它不能透過具備完整細(xì)胞膜的正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞，但能夠透過凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜而將細(xì)胞核染色，在特定激發(fā)光條件下呈現(xiàn)紅色。

        將 Annexin V-FITC 與 PI 匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，若橫坐標(biāo)表示 Annexin V 信號(hào)，縱坐標(biāo)表示PI 信號(hào)，則左下象限 (Annexin V-/PI-)  **活細(xì)胞；右下象限(Annexin V+ /PI-)  **早期凋亡細(xì)胞；右上象限(Annexin V+ /PI+)**凋亡晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞；左上象限(Annexin V-/PI+)  被認(rèn)為是許可范圍內(nèi)的檢測(cè)誤差。

檢測(cè)方法

         利用流式細(xì)胞儀或者熒光顯微鏡檢測(cè)懸浮細(xì)胞或者貼壁細(xì)胞中的綠色熒光信號(hào)（Annexin V-FITC）以及紅色熒光信號(hào)（PI）。

產(chǎn)品特點(diǎn)

         該產(chǎn)品能夠在極短的時(shí)間內(nèi)方便、高效、準(zhǔn)確的區(qū)分正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死的細(xì)胞，并計(jì)算各群細(xì)胞的比例。
產(chǎn)品組分

運(yùn)輸及保存方式

        藍(lán)冰運(yùn)輸。-20℃避光長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融。如短時(shí)間內(nèi)需多次重復(fù)使用， 請(qǐng)于 4℃避光保存，有效期半年。

使用注意事項(xiàng)

1、螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請(qǐng)低速短暫離心，將管內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落造成損失。
2、細(xì)胞處理需小心操作，避免人為的損傷細(xì)胞。
3、細(xì)胞凋亡是一個(gè)快速和動(dòng)態(tài)的過程，因此建議在染色后立即進(jìn)行分析。
4、Annexin V-FITC 和 PI 是光敏感物質(zhì)，在操作時(shí)應(yīng)注意避光，盡量減少暴露在光下的時(shí)間，必要時(shí)請(qǐng)使用帶蓋子的冰盒或者鋁箔紙進(jìn)行避光操作。
5、使用該試劑盒檢測(cè)凋亡是針對(duì)活細(xì)胞，不需要固定細(xì)胞，否則會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾。
6、如果細(xì)胞樣品中含有血小板，請(qǐng)使用含有 EDTA 的緩沖劑并低速離心洗去血小板后再進(jìn)行檢測(cè)，因?yàn)檠“搴?PS，能夠與 Annexin V 結(jié)合。
7、對(duì)于貼壁細(xì)胞，消化是一個(gè)關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡時(shí)如有漂浮細(xì)胞， 需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色，操作過程中需嚴(yán)格控制胰酶的消化時(shí)間， 時(shí)間過短，細(xì)胞需要用力吹打才能夠脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷，使得 PI 攝入過多；消化時(shí)間過長(zhǎng)，細(xì)胞膜同樣會(huì)產(chǎn)生損傷，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上的 PS 與 Annexin V 的結(jié)合。消化時(shí)將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖使胰酶與細(xì)胞充分解除，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時(shí)間，待細(xì)胞空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。

8、如果細(xì)胞收集過程中使用了胰酶，需注意用 PBS 洗凈去除殘留的胰酶，因?yàn)橐让笗?huì)消化并降解 Annexin V-FITC，*終導(dǎo)致染色失?。?br/>9、盡量避免在消化液中使用 EDTA 或者 EGTA，因?yàn)?EDTA 和 EGTA 會(huì)螯合鈣離子，而 Annexin  V 與 PS 的結(jié)合是依賴于鈣離子的，因此這兩種物質(zhì)的存在或者殘留會(huì)影響 Annexin V 與 PS 的結(jié)合，進(jìn)而影響信號(hào)的檢測(cè)。
10、成功的檢測(cè)凋亡受以下幾種因素的影響，如細(xì)胞類型、細(xì)胞膜上的 PS 的密度、發(fā)生凋亡時(shí) PS 翻轉(zhuǎn)的比例、誘導(dǎo)凋亡的方法、所用試劑、誘導(dǎo)凋亡的時(shí)間以及實(shí)驗(yàn)過程中機(jī)械損傷的程度等，把這些因素進(jìn)行優(yōu)化對(duì)實(shí)驗(yàn)成功與否非常重要。請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣本和操作流程對(duì)這些步驟進(jìn)行優(yōu)化后再進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)步驟

1、懸浮細(xì)胞：300 g，4°C 離心 5 分鐘收集細(xì)胞；
      貼壁細(xì)胞：用不含 EDTA 的胰酶進(jìn)行消化后，300 g，4°C 離心 5 分鐘收集細(xì)胞。胰酶的消化時(shí)間不宜過長(zhǎng)，以防引起假陽性。
2、用預(yù)冷的 PBS 溶液洗滌細(xì)胞兩次，每次均以 300 g，4°C 離心 5 分鐘收集細(xì)胞，并盡量去除 PBS 溶液。(可以用大 Tip 上套上小 Tip 去盡量去除 PBS 溶液)
3、加入 100 μl 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。
4、加入 5 μl Annexin V-FITC 染色液和 10 μl PI 染色液，輕輕混勻。
5、室溫、避光孵育 10-15 分鐘。
6、再加入 400 μl 結(jié)合緩沖液，混勻后置于冰上。
7、立即用流式細(xì)胞儀或者熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。

樣品分析

1、流式細(xì)胞儀分析
         FITC 的激發(fā)波長(zhǎng)不應(yīng)超過488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)不應(yīng)超過 525 nm，F(xiàn)ITC 的綠色熒光在FL1 通道檢測(cè)；PI-DNA 復(fù)合物的**激發(fā)波長(zhǎng)為 535 nm，**發(fā)射波長(zhǎng)為 615 nm， PI 的紅色熒光在 FL2 或 FL3 通道檢測(cè)。用分析軟件繪制雙色散點(diǎn)圖，F(xiàn)ITC 為橫坐標(biāo)，PI 為縱坐標(biāo)。典型的實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞可以分成三個(gè)亞群，活細(xì)胞僅有很低強(qiáng)度的熒光，早期凋亡細(xì)胞僅有較強(qiáng)的綠色熒光，晚期凋亡的細(xì)胞有綠色和紅色熒光的雙重染色。

2、熒光顯微鏡觀察
        滴加 30-50 μl 用 Annexin V-FITC/PI 雙染色的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞，然后在熒光顯微鏡下用雙色濾光片進(jìn)行觀察。Annexin V-FITC 的熒光信號(hào)呈綠色，PI 的熒光信號(hào)為紅色。因此 Annexin V-FITC 陽性的細(xì)胞將在細(xì)胞膜表面呈現(xiàn)明亮的綠色，而 PI 陽性的細(xì)胞則會(huì)在整個(gè)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)不同強(qiáng)度的黃-紅色。早期凋亡的細(xì)胞只呈現(xiàn)綠色，而壞死和晚期凋亡細(xì)胞則會(huì)顯示黃-紅色的胞質(zhì)，紅色的細(xì)胞核以及環(huán)繞細(xì)胞的綠色的胞膜，在晚期凋亡的細(xì)胞中還可以觀察到胞膜皺縮和起泡。
【注】：對(duì)于貼壁細(xì)胞，可直接用蓋玻片培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，然后染色后將蓋玻片置于載玻片上進(jìn)行熒光顯微鏡觀察即可。

常見問題分析

實(shí)驗(yàn)過程中 Annexin V 染不上色或陽性率偏低。

可能的原因如下：
1、確定實(shí)驗(yàn)中的誘導(dǎo)劑是否能夠有效產(chǎn)生凋亡。可以通過設(shè)定確切凋亡誘導(dǎo)的陽**物對(duì)照來排除這一情況。
2、消化液中的胰酶或 EDTA 等是否去除干凈，建議使用無 EDTA 的胰酶進(jìn)行消化，或者消化后用 PBS 徹底洗滌干凈。
3、細(xì)胞用預(yù)冷的 PBS 洗滌后，離心，應(yīng)盡量吸干殘余液體，因?yàn)?PBS 中含有的磷酸根離子會(huì)與結(jié)合緩沖液中的鈣離子形成磷酸鈣沉淀，進(jìn)而影響 Annexin V 的染色。
4、結(jié)合緩沖液瓶蓋需蓋緊密封，長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中后，空氣中的二氧化碳會(huì)與鈣離子形成碳酸鈣沉淀，從而導(dǎo)致鈣離子濃度降低，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不佳。
5、吸取完 PBS 的*頭如果不更換，繼續(xù)取結(jié)合緩沖液，也會(huì)導(dǎo)致結(jié)合緩沖液中游離鈣離子的減少，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不佳。
6、陽性細(xì)胞的丟失。如果是貼壁細(xì)胞，藥物誘導(dǎo)后漂浮細(xì)胞也應(yīng)該和貼壁細(xì)胞一起收集后合并檢測(cè)，漂浮細(xì)胞往往是凋亡陽性的細(xì)胞，否則丟失漂浮細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致陽性結(jié)果偏低。

實(shí)驗(yàn)過程中陽性率偏高。

可能的原因如下：
1、細(xì)胞本身活力太差。若實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)未經(jīng)誘導(dǎo)凋亡的對(duì)照細(xì)胞經(jīng)染色后Annexin V+/PI+雙陽性的細(xì)胞比例過高，可能的原因是細(xì)胞本身活力太差，建議用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞活力，拒染細(xì)胞比例應(yīng)大于 95%；若活力偏低，建議重新復(fù)蘇細(xì)胞，剛剛復(fù)蘇的細(xì)胞至少要傳代 3 次以后才能進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。
2、細(xì)胞操作不當(dāng)。貼壁細(xì)胞消化過程中避免反復(fù)劇烈吹打?qū)е录?xì)胞膜破壞，假陽性偏高。
3、凋亡誘導(dǎo)時(shí)間過長(zhǎng)。誘導(dǎo)時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)耗盡，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差， 假陽性偏高。