Cell Counting Kit-8 (CCK-8)
細胞活力檢測試劑盒
使用說明

產品組分

產品簡介
       Cell Counting Kit-8簡稱CCK-8細胞活力檢測試劑盒，是一種利用WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺基苯基）-2H-）進行方便的分析四唑鹽，-鈉鹽），其在電子載體1-甲氧基PMS存在下可以被線粒體內的脫氫酶還原產生高度水溶性的橙黃色的甲瓚產物，屬于MTT的升級產品。將CCK-8溶液直接添加到細胞中，不需要預先混合組分。產生的甲瓚產物的量（即顏色的深淺）與活細胞的數(shù)量成正比，與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。

圖1. CCK-8工作原理圖

       由于CCK-8溶液非常穩(wěn)定并且?guī)缀鯖]有細胞毒性，因此可以進行更長時間的孵育，例如24小時至48小時。CCK-8試劑盒允許靈敏的比色測定法測定增殖和細胞毒性測定中活細胞的數(shù)量，檢測靈敏度高于任何其他四唑鹽，如MTT，XTT或MTS。CCK-8法應用非常**，如藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、**藥物試驗以及生物因子的活性檢測等方面。

表1. 細胞增殖與毒性檢測試劑的對比表

檢測方法
      利用酶標儀檢測450nm處的吸光值。

運輸及保存方式
      藍冰運輸。2-8℃避光保存，有效期一年，-20℃保存，有效期兩年，但反復凍融會增加背景值。如短時間內需多次重復使用，請于4℃避光保存。

使用注意事項
    1、確保藥物和CCK-8均勻分布在培養(yǎng)基中。
    2、細胞增殖越多，顏色越深；細胞毒性越強，顏色越淺。建議先做幾個孔摸索接種細胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時間。
    3、對于貼壁細胞，每孔至少需要1000個細胞（100 μl 培養(yǎng)基）。對于白細胞，由于靈敏度較低，每孔至少需要2500個細胞（100 μl 培養(yǎng)基）。推薦的96孔板每孔**細胞數(shù)為25000。如果使用24孔或6孔板進行該檢測，請計算相應的每孔的細胞數(shù)，并調整CCK-8的體積，使其為每孔總液體體積的10%。
    4、因為CCK-8測定是基于活細胞中的脫氧酶活性，影響脫氧酶活性的條件或化學物質可能導致實際活細胞數(shù)與使用CCK-8測定活細胞之間有差異。
    5、WST-8可能與還原劑反應生成WST-8 Formazan。如果使用還原劑（例如一些抗氧化劑）會干擾檢測。如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設法去除。
    6、孵育2小時后，背景OD值一般為0.1-0.2單位。并且注意不要在孔中引入氣泡，因為它們會干擾OD值。
    7、如果您想對CCK-8溶液進行滅菌，請使用0.2 μm的膜過濾溶液。
    8、CCK-8不能用于細胞染色。
    9、培養(yǎng)基中的酚紅不會影響實驗結果，酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。
   10、我們建議將細胞接種在靠近培養(yǎng)板中央的孔中，***一圈孔中的培養(yǎng)基容易蒸發(fā)，可以用PBS，水或培養(yǎng)基填充這些孔，不作為測定孔用。
   11、如果細胞培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，應洗滌細胞更換培養(yǎng)基后再加CCK-8試劑進行檢測。
   12、為了您的安全和健康，操作時請穿著實驗服并佩戴一次性手套。

實驗步驟

（1）制作標準曲線
1、制備細胞懸液：細胞計數(shù)。
2、接種到96孔板中：按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成細胞濃度梯度，一般要做3~5個細胞濃度梯度，每組3~6個重復孔。每孔約100 μl細胞懸液。
3、細胞培養(yǎng)：細胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2~4小時（備注：如果不需要貼壁，這一步可以省略）。
4、每孔加入10 μl CCK-8溶液，由于每孔中加入的CCK-8溶液較少，為了減少試劑沾在孔壁或者*頭帶來的誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻，或者直接配置含10% CCK-8溶液的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。
5、培養(yǎng)箱內孵育一定時間后測定450nm吸光度，制作出一條以細胞數(shù)量為橫坐標（即X軸），以吸光度為縱坐標（即Y軸）的標準曲線。根據(jù)此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數(shù)量。（備注：使用該標準曲線的前提是實驗的條件一定要一致，比如加入的CCK-8溶液的量以及培養(yǎng)孵育的時間等，以便于確定細胞的接種數(shù)量）

（2）細胞活性檢測
 1、制備細胞懸液：細胞計數(shù)。
 2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細胞數(shù)，每孔約100 μl細胞懸液，可設置3個重復孔。
 3、細胞培養(yǎng)：細胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2~4小時（備注：如果不需要貼壁，這一步可以省略）。
 4、每孔加入10 μl CCK-8溶液，由于每孔中加入的CCK-8溶液較少，為了減少試劑沾在孔壁或者*頭帶來的誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻，或者直接配置含10% CCK-8溶液的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。
 5、培養(yǎng)箱內孵育0.5~4小時：細胞種類不同，形成的甲瓚的數(shù)量也不一樣，一般情況下孵育1小時即可。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認**條件。尤其是血細胞，形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。
6、測定450nm吸光度：直接利用酶標儀檢測450nm處的吸光值。如果暫時不測定吸光值可以向每孔中加入10 μl自己配置的0.1M HCl溶液或1% SDS溶液并將培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下，在24小時內吸光度不會發(fā)生變化。

（3）細胞增殖-毒性檢測
1、制備細胞懸液：細胞計數(shù)。
2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細胞數(shù)，每孔約100 μl細胞懸液，可設置3個重復孔。
3、細胞培養(yǎng)：細胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2~4小時（備注：如果不需要貼壁，這一步可以省略；或者根據(jù)實驗要求的不同，培養(yǎng)相應的時間）。
4、每孔加入0-10 μl 不同濃度的待測藥物。
5、培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞：加入待測藥物的培養(yǎng)時間，需要根據(jù)藥物的性質和細胞的敏感度以及細胞的周期來決定，*少要一代以上的時間。
6、每孔加入10 μl CCK-8溶液，由于每孔中加入的CCK-8溶液較少，為了減少試劑沾在孔壁或者*頭帶來的誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻，或者直接配置含10% CCK-8溶液的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。（備注：如果待測物質有氧化性或者還原性的話，可在加入CCK-8溶液之前除去培養(yǎng)基，并用新鮮的培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基以去掉藥物對CCK-8檢測結果的影響。當然，如果藥物的影響較小，也可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收值即可。）
7、培養(yǎng)箱內孵育0.5~4小時：細胞種類不同，形成的甲瓚的數(shù)量也不一樣，一般情況下孵育1小時即可。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認**條件。尤其是血細胞，形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。
8、測定450nm吸光度：直接利用酶標儀檢測450nm處的吸光值。如果暫時不測定吸光值可以向每孔中加入10 μl自己配置的0.1M HCl溶液或1% SDS溶液并將培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下，在24小時內吸光度不會發(fā)生變化。

（4）計算公式
細胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)]×100%
**率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)]×100%
As: 實驗孔（含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測藥物）的吸光度
Ac: 對照孔（含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒有待測藥物）的吸光度
Ab: 空白孔（不含細胞和待測藥物的培養(yǎng)基、CCK-8）的吸光度

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