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EdU細胞增殖檢測

細胞增殖是評價細胞活性、代謝、生理 和病理狀況的重要指標。EdU (5-Ethynyl-2,- deoxyuridine)是一種胸腺喃陡核苷類似物,其連 有的炔烴基團在天然化合物中很少見,能夠在 細胞增殖時期代替胸腺嘧啶(T)摻入正在復制 的DNA分子中,通過基于EdU與熒光染料的 特異性共軛反應,把熒光集團標記到新合成的 含有EdU的DNA上面,這樣就可以進行高效 快速的檢測出DNA復制活性,廣泛應用于細胞 增殖、細胞分化、生長與發(fā)育、DNA損傷修復 等方面的研究。
EdU細胞增殖檢測

EdU細胞増殖檢測試劑盒(紅色熒光)使用說明

 

產品簡介

       細胞增殖是評價細胞活性、代謝、生理和病理狀況的重要指標。EdU (5-Ethynyl-2,- deoxyuridine)是一種胸腺嘧啶核苷類似物,其連有的炔烴基團在天然化合物中很少見,能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶(T)摻入正在復制的DNA分子中,通過基于EdU與熒光染料的特異性共軛反應,把熒光集團標記到新合成的含有EdU的DNA上面,這樣就可以進行高效快速的檢測出DNA復制活性,廣泛應用于細胞增殖、細胞分化、生長與發(fā)育、DNA損傷修復等方面的研究。
       傳統(tǒng)的免疫熒光染色(BrdU)檢測方法需要DNA變性、抗原修復、抗原抗體過夜孵育等復雜繁瑣的操作步驟。而EdU檢測方法不需要劇烈的DNA變性,只需溫和的細胞固定化和透化處理,能夠較好地保護細胞形態(tài)、DNA整體結構及細胞內抗原識別位點,操作步驟更加快速、靈敏和準確。EdU與胸腺嘧啶(T )結構非常相似,而EdU染料大小只有BrdU抗體的1/500,在細胞內很容易擴散,無需DNA變性(酸解、熱解、酶解等),可有效避免樣品損傷,而且無需抗原抗體反應,能在細胞和組織水平更快速便捷地反映DNA復制活性。

試劑盒組分


產品編號

試劑

濃度

試劑量

保存條件

 
 
 
C1501/1502/1503
 
 

EdU溶液

1000X

40ul

室溫運輸,4℃長期儲存,勿凍存,熒光試劑請避光保存。

反應緩沖液

10X

1 ml

催化劑溶液

25x

400ul

TAMRA 紅 色熒光溶液

400x

25ul

緩沖添加劑

粉末

200 mg

Hoechst 33342

1000X

20ul

 


使用前須知
       該產品是采用成像檢測方法對貼壁細胞進行檢測,適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡等儀器。非貼壁細胞可在孵育EdU后進行細胞涂片處理,固定后再采用貼壁細胞的染色流程進行檢測。也可以應用于流式細胞儀檢測。

實驗步驟(以24孔板,HK2貼壁細胞為例)

EdU標記
(a)      將細胞完全培養(yǎng)基中按照500: 1的 比例加入EdU溶液,制成2xEdU標記培養(yǎng)基;
(b)      提前將2xEdU標記培養(yǎng)基預熱,然后等體積加入到細胞原有培養(yǎng)基中,獲得lxEdU溶液,其中EdU的終濃度為10 uM;
注:    1)我們不建議替換全部培養(yǎng)基,因為這樣可能會影響細胞增殖的速度;
           2)配置好的培養(yǎng)基建議現(xiàn)用現(xiàn)配,用量以沒過細胞為宜;
(c)      每孔加入300ul含EdU培養(yǎng)基孵育細胞2小時,棄培養(yǎng)基;
注:   1)培養(yǎng)時間取決于細胞的增殖速度和生長狀態(tài);
          2)大多數(shù)**細胞以及粘附細胞系均可采用2小時的孵育時間
(d)     以lxPBS清洗細胞兩次,毎次5分鐘,以除去未摻入DNA的EdU殘留。
注:  貼壁不牢的細胞可降低清洗強度。

細胞的固定和通透
(a)     每孔加入150ul 4%多聚甲醛細胞固定液,室溫培養(yǎng)30分鐘,棄固定液;
(b )    毎孔加入150ul 2mg/ml甘氨酸,搖床孵育5分鐘,以中和過量的多聚甲醛;
(c )    棄甘氨酸溶液,每孔加入300 ul PBS 洗液,室溫清洗5分鐘;

(d)     每孔加入300ul 0.5% Triton X-100細胞通透液,室溫通透10分鐘,棄細胞通透溶液;
(e )    每孔加入300ul PBS洗液,室溫清洗5分鐘;

EdU染色
(a)     通過用10: 1去離子水稀釋10x反應緩沖液進行配制1xEdU反應緩沖液;
(b)     按照溶解200mg緩沖添加劑溶于1ml去離子水的比例稱取適量的粉末進行溶解, 即為可用的緩沖添加劑的濃度,建議現(xiàn)用現(xiàn)配;
注:  緩沖添加劑為白色粉末,較難準確稱量,稱量范圍可稍微放寬,但是不應超過±20%,且該粉末較易氧化,使用后請旋緊管蓋,如試劑出現(xiàn)棕黃色,則需報廢或更換。
(c)     按照以下的表格進行染色反應液的配制:

染色反應液組分

500ul

1 ml

2 ml

5 ml

IX反應緩沖液

430ul

860ul

1.8 ml

4.3 ml

催化劑溶液

20 ul

40 ul

80 ul

200 ul

TAMRA紅色熒光溶液

1.2 ul

2.5 ul

5 ul

12.5 ul

緩沖添加劑

50 ul

100 ul

200 ul

500 ul


(d)     每孔加入100ul配置好的檢測混合液,以覆蓋細胞為宜,避光、室溫孵育30分鐘。
(e)     棄染色反應液,加入300 ul  0.5% TritonX-100細胞滲透液清洗2-3次,每次10 分鐘;
(f)      棄細胞滲透液,用PBS洗兩次,每次5分鐘。


DNA染色

(a )    將Hoechst 33342用PBS 溶液1: 1000 進行稀釋得到終濃度為5ug/ml的 lx Hoechst染色液;
(b )    每孔加入300ul 1x Hoechst染色液,室溫避光孵育20-30分鐘后,棄染色液;
(c )    每孔加入300ul PBS洗細胞兩次,去掉洗液。