RNA提取過(guò)程中試劑的作用是什么？
想必大家都會(huì)有這樣的一個(gè)疑問(wèn)，RNA提取過(guò)程中試劑的作用是什么呢？下面就跟著上海東寰一起來(lái)看看吧。
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氯仿是分子量比較大的有機(jī)溶劑，在提取RNA時(shí)，氯仿可以有效的使有機(jī)相和無(wú)機(jī)相迅速分離。RNA提取過(guò)程，有機(jī)相中主要是酚和蛋白結(jié)合，從而使得蛋白和RNA脫離，RNA進(jìn)入水相。下面就由 氯仿的作用有多個(gè)方面，加入氯仿，雖然有變性蛋白質(zhì)的作用，但是其主要用處是用來(lái)分相，實(shí)際上是加速有機(jī)相和水相的分層。
一般的trizol試劑在4度下是油狀懸浮液，提高溫度，放置一段時(shí)間，自然也會(huì)分相。離心后混合物分成三層：下層苯酚-氯仿層，中間層，上層無(wú)色的水樣層。RNA無(wú)一例外地存在于水樣層當(dāng)中。水樣層的容量大約為400ul?！緲?biāo)準(zhǔn)：1mlTrizol加200ul的氯仿，水樣層的容量大約為所加Trizol 容量的60% 】 上層水相，PH 5.1左右，當(dāng)溶液pH在酸性的時(shí)候，RNA分子就會(huì)沉淀在酚與溶液的界面，只有RNA分子留在水相。而當(dāng)pH接近中性時(shí)，RNA就會(huì)溶解在水相，（導(dǎo)致PH中性的大概原因是trizol與樣品比例不對(duì)，應(yīng)該盡量保證提取量的前提下使trizol過(guò)量） Trizol法提RNA，加氯仿就是要?jiǎng)×艺鹗幉判?，這樣才能徹底地兩相混勻。
異丙醇的作用是通過(guò)-OH的疏水作用使得RNA鏈中的親水基團(tuán)受到保護(hù)，等同于沉淀，但是這是個(gè)反應(yīng)時(shí)發(fā)生在水相中，與前面的氯仿不矛盾。通過(guò)將水樣層和異丙醇混合來(lái)沉淀RNA， RNA沉淀在離心前通常不可見(jiàn)，形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。 異丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一樣。只不過(guò)用量少一點(diǎn)，0.6V~1V就夠了，在水相很多，離心管容積有限，加不下太多乙醇的時(shí)候一般會(huì)用異丙醇沉淀。不過(guò)感覺(jué)效果不如乙醇，偶爾會(huì)有沉淀不出來(lái)東西的時(shí)候?！?00ul的水相對(duì)應(yīng)500ul的的異丙醇?！?醇沉淀是很經(jīng)常用的方法，因?yàn)镽NA和某些雜質(zhì)不溶于異丙醇，所以可以用來(lái)沉淀。
乙醇沉淀的主要目的是沉淀+除鹽。 TRIzol主要物質(zhì)是異硫氰酸胍，它可以破壞細(xì)胞使ＲＮＡ釋放出來(lái)的同時(shí)，保護(hù)ＲＮＡ的完整性 。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA 可以通過(guò)異丙醇沉淀來(lái)還原。 無(wú)論是人、動(dòng)物、植物還是細(xì)菌組織，TRIzol法對(duì)少量的組織(50-100 mg)和細(xì)胞(5×106)以及大量的組織(≥1 g)和細(xì)胞(>107)均有較好的分離效果。TRIZOL試劑操作上的簡(jiǎn)單性允許同時(shí)處理多個(gè)的樣品。所有的操作可以在一小時(shí)內(nèi)完成。TRIZOL抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白的污染。故而能夠作RNA 印 跡分析、斑點(diǎn)雜交、poly(A)+ 選擇、體外翻譯、RNA酶保護(hù)分析和分子克隆。
上面就是上海東寰為您分享的小知識(shí)，如果您想了解更多，歡迎在線(xiàn)咨詢(xún)或撥打客服熱線(xiàn)，我們將提供全心全意的服務(wù)！
氯仿是分子量比較大的有機(jī)溶劑，在提取RNA時(shí)，氯仿可以有效的使有機(jī)相和無(wú)機(jī)相迅速分離。RNA提取過(guò)程，有機(jī)相中主要是酚和蛋白結(jié)合，從而使得蛋白和RNA脫離，RNA進(jìn)入水相。下面就由 氯仿的作用有多個(gè)方面，加入氯仿，雖然有變性蛋白質(zhì)的作用，但是其主要用處是用來(lái)分相，實(shí)際上是加速有機(jī)相和水相的分層。
一般的trizol試劑在4度下是油狀懸浮液，提高溫度，放置一段時(shí)間，自然也會(huì)分相。離心后混合物分成三層：下層苯酚-氯仿層，中間層，上層無(wú)色的水樣層。RNA無(wú)一例外地存在于水樣層當(dāng)中。水樣層的容量大約為400ul?！緲?biāo)準(zhǔn)：1mlTrizol加200ul的氯仿，水樣層的容量大約為所加Trizol 容量的60% 】 上層水相，PH 5.1左右，當(dāng)溶液pH在酸性的時(shí)候，RNA分子就會(huì)沉淀在酚與溶液的界面，只有RNA分子留在水相。而當(dāng)pH接近中性時(shí)，RNA就會(huì)溶解在水相，（導(dǎo)致PH中性的大概原因是trizol與樣品比例不對(duì)，應(yīng)該盡量保證提取量的前提下使trizol過(guò)量） Trizol法提RNA，加氯仿就是要?jiǎng)×艺鹗幉判?，這樣才能徹底地兩相混勻。
異丙醇的作用是通過(guò)-OH的疏水作用使得RNA鏈中的親水基團(tuán)受到保護(hù)，等同于沉淀，但是這是個(gè)反應(yīng)時(shí)發(fā)生在水相中，與前面的氯仿不矛盾。通過(guò)將水樣層和異丙醇混合來(lái)沉淀RNA， RNA沉淀在離心前通常不可見(jiàn)，形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。 異丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一樣。只不過(guò)用量少一點(diǎn)，0.6V~1V就夠了，在水相很多，離心管容積有限，加不下太多乙醇的時(shí)候一般會(huì)用異丙醇沉淀。不過(guò)感覺(jué)效果不如乙醇，偶爾會(huì)有沉淀不出來(lái)東西的時(shí)候?！?00ul的水相對(duì)應(yīng)500ul的的異丙醇?！?醇沉淀是很經(jīng)常用的方法，因?yàn)镽NA和某些雜質(zhì)不溶于異丙醇，所以可以用來(lái)沉淀。
乙醇沉淀的主要目的是沉淀+除鹽。 TRIzol主要物質(zhì)是異硫氰酸胍，它可以破壞細(xì)胞使ＲＮＡ釋放出來(lái)的同時(shí)，保護(hù)ＲＮＡ的完整性 。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA 可以通過(guò)異丙醇沉淀來(lái)還原。 無(wú)論是人、動(dòng)物、植物還是細(xì)菌組織，TRIzol法對(duì)少量的組織(50-100 mg)和細(xì)胞(5×106)以及大量的組織(≥1 g)和細(xì)胞(>107)均有較好的分離效果。TRIZOL試劑操作上的簡(jiǎn)單性允許同時(shí)處理多個(gè)的樣品。所有的操作可以在一小時(shí)內(nèi)完成。TRIZOL抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白的污染。故而能夠作RNA 印 跡分析、斑點(diǎn)雜交、poly(A)+ 選擇、體外翻譯、RNA酶保護(hù)分析和分子克隆。
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