腫瘤細(xì)胞侵襲能力檢測在腫瘤學(xué)(遷移、侵襲)和免疫學(xué)(遷移、趨化)中是常規(guī)實(shí)驗(yàn)。侵襲是細(xì)胞遷移的一種。細(xì)胞遷移分三種類型:趨觸、趨化和侵襲。腫瘤細(xì)胞的侵襲性是腫瘤相關(guān)信號通路、藥物治療、靶向治療、致癌/抑癌基因等腫瘤學(xué)研究的一個重要指標(biāo)。
為了對腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有更加清晰的理解,我們先來了解一下,腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程,主要包括以下5個過程:原位侵襲,腫瘤細(xì)胞內(nèi)滲,循環(huán)系統(tǒng)存活,腫瘤細(xì)胞外滲,形成轉(zhuǎn)移灶等。其中細(xì)胞侵襲便發(fā)生在第一步,即腫瘤細(xì)胞在原位突破基底膜,然后內(nèi)滲進(jìn)入血管、淋巴管的過程,后期才開始進(jìn)行轉(zhuǎn)移。
實(shí)驗(yàn)原理
簡單來說,將Transwell小室放入培養(yǎng)板中,并將高營養(yǎng)液與低營養(yǎng)液用一層膜隔開,并在膜上室鋪基質(zhì)膠,用來模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)。腫瘤細(xì)胞放在低營養(yǎng)液中,為了獲得更多的營養(yǎng)吃的更飽,這些細(xì)胞需先分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)將基質(zhì)膠降解,才能穿過這層膜,進(jìn)入高營養(yǎng)液,最后通過計(jì)數(shù)下室的細(xì)胞量即可反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。
實(shí)驗(yàn)方法
1、復(fù)蘇代數(shù)靠前的腫瘤細(xì)胞,在含有10% FBS的培養(yǎng)基中預(yù)先培養(yǎng)2-3代,待細(xì)胞匯合達(dá)到80%左右,饑餓處理18-24小時。
2、準(zhǔn)備鋪膠:
a)4 °C溶matirgel膠過夜
b)將細(xì)胞小室、培養(yǎng)板和槍頭等于4°C 預(yù)冷
c)用無血清的冷培養(yǎng)基稀釋matirgel膠至一定濃度,加入到細(xì)胞小室的上層(按照產(chǎn)品說明書的推薦比例和體積),輕輕搖晃使膠均勻鋪在膜上。以上操作在冰上進(jìn)行
d)立即將鋪好matrigel膠的細(xì)胞小室置于培養(yǎng)板中,于37°C孵育1小時左右,matirgel膠可由液體凝成固體,吸走多余的或者未凝的膠
3、細(xì)胞用PBS清洗一次,胰酶消化,然后用包含5% BSA的無血清培養(yǎng)基中和,1500rpm離心5-10min。
4、用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度
5、取上述細(xì)胞液加入小室,下室(培養(yǎng)板)加入含有10% FBS的培養(yǎng)基。不同規(guī)格的小室和培養(yǎng)板所加的體積不同,具體參考產(chǎn)品說明書
6、37 °C孵育24至72小時,依據(jù)腫瘤細(xì)胞類型而定
7、孵育結(jié)束,小心取出細(xì)胞小室,吸掉小室上層培養(yǎng)液,PBS清洗一遍,70%酒精或者4%多聚甲醛固定5min,0.5%結(jié)晶紫(2%乙醇或PBS溶解)染色20min,然后進(jìn)行第8步或者第9步。
8、PBS清洗兩次以去除多余的染料,立即用棉簽擦去濾膜上層的細(xì)胞,自然靜置風(fēng)干。顯微鏡下觀察濾膜下層的細(xì)胞,隨機(jī)選取不同的視野計(jì)數(shù)并算平均值。
9、結(jié)晶紫溶解濾膜下層細(xì)胞,然后用33%醋酸脫色,將結(jié)晶紫完全洗脫下來,洗脫液可在酶標(biāo)儀上570nm讀取OD值。這種方法可以避免視野下細(xì)胞穿透不均勻帶來的誤差。
10、計(jì)數(shù):Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析有兩種方法
直接計(jì)數(shù)法:通過給細(xì)胞染色,直接在鏡下計(jì)數(shù)。選擇不同的視野拍照(一般選擇呈現(xiàn)視野中穿過的細(xì)胞),計(jì)數(shù)的結(jié)果可做成統(tǒng)計(jì)圖,輔助呈現(xiàn)數(shù)據(jù)。
間接計(jì)數(shù)法:主要用于穿過細(xì)胞過多,而無法通過計(jì)數(shù)獲得準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)所采用的方法,與常用的MTT實(shí)驗(yàn)是同樣的原理。它包括:MTT法、 熒光試劑檢測、 結(jié)晶紫檢測。
注意事項(xiàng)
1、腫瘤細(xì)胞最好經(jīng)過饑餓處理,并且小室上下培養(yǎng)基的FBS有濃度差,以保證細(xì)胞可以穿透基質(zhì)膠。
2、鋪細(xì)胞要均勻,濾膜底部不能產(chǎn)生氣泡,否則會導(dǎo)致細(xì)胞染色不均勻,或者局部細(xì)胞無法穿透。
3、侵襲實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞密度比較大,不同腫瘤細(xì)胞的接種密度、培養(yǎng)時間不同,需要實(shí)驗(yàn)摸索。細(xì)胞太少,遷移不過去;細(xì)胞太多,可能導(dǎo)致正常組和實(shí)驗(yàn)組無差異。
4、首次做實(shí)驗(yàn)需要用正常的細(xì)胞摸索合適的細(xì)胞密度和培養(yǎng)時間,確定之后再加實(shí)驗(yàn)組,同時如果條件允許,設(shè)置一組已知高遷移性的細(xì)胞作陽性對照。
5、注意細(xì)胞小室內(nèi)外培養(yǎng)基的比例,不要使小室外培養(yǎng)基超過小室內(nèi)培養(yǎng)基液面。
6、觀察細(xì)胞時一定要擦去小室內(nèi)部貼在膜上的細(xì)胞。
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