WB實驗干貨-實驗介紹、蛋白提取、蛋白定量

一、WB實驗介紹

WB（Western Blot，蛋白免疫印跡）是一種常規(guī)的蛋白分析技術(shù)，常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。

WB實驗的基本核心理念是抗原抗體的特異性反應(yīng)，通過變性膠 SDS-PAGE 將不同分子量的蛋白質(zhì)分離開，然后轉(zhuǎn)移到固相載體 PVDF 膜上，再用脫脂牛奶作為封閉液進行封閉和一抗稀釋液進行稀釋。待目的蛋白和抗體充分結(jié)合后，用 TBST 洗脫液洗脫掉多余未結(jié)合的一抗，加入帶有 HRP 標記的對應(yīng)二抗，這樣，我們的蛋白+一抗+二抗形成一個復(fù)合物，加以化學發(fā)光液，有靶蛋白的位置就會產(chǎn)生熒光，利用膠片或者化學發(fā)光儀就可以顯現(xiàn)靶蛋白的條帶顯現(xiàn)。

WB常規(guī)實驗流程：蛋白提取→蛋白定量→制膠→電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→一抗孵育→一抗洗脫→二抗孵育→二抗洗脫→化學發(fā)光→數(shù)據(jù)分析。

二、WB實驗試劑配置

在實驗開始之前，可以按以下配方比例配置實驗所需試劑。

1.電泳緩沖液 

取 電泳緩沖液干粉（G2018-1L），溶解于 1L 純水（G4701-500ML）中，置于磁力攪拌器（MS-150）上攪拌充分溶解。

2. 轉(zhuǎn)膜緩沖液 

取 轉(zhuǎn)膜緩沖液干粉（G2017-1L），溶解于 800mL 純水中，加入 200mL 的甲醇，置于磁力攪拌器上攪拌充分溶解。

3. TBST 緩沖液 

取 TBS 粉劑（G0001-2L），溶解于 2L 純水中，加入 1mL 吐溫20，置于磁力攪拌器上攪拌充分溶解。

4. 5%脫脂牛奶 

稱量 5g 脫脂奶粉（G5002-100G），溶解于 100mL TBST 溶液（G0004-500ML）中，置于磁力攪拌器上攪拌至少 30分鐘，然后放入 4℃冰箱暫放。

5.完全裂解液

1mL RIPA 裂解液（G2002-100ML或G2033-100ML）+20μL cocktail（G2006-250UL）+10μL磷酸化蛋白酶抑制劑 A（G2007-1ML）+10μL 磷酸化蛋白酶抑制劑 B（G2007-1ML）+10μL PMSF（G2008-1ML），除 RIPA 外，其他四種試劑使用前幾分鐘加入，現(xiàn)配現(xiàn)用。

三、WB實驗步驟

由于文章篇幅限制，小賽這次先介紹組織或細胞的蛋白提取和蛋白定量常規(guī)流程。

蛋白提取

1 .組織總蛋白提取

準備好所需要數(shù)量的樣本管；放入研磨珠，置于冰盒上備用；

組織塊先用預(yù)冷 PBS洗滌 2-3 次，除去血污，然后放在濾紙上，吸盡多余的 PBS 后放入對應(yīng)的勻漿管中，加入大約 10 倍樣本體積的完全裂解液，置于組織研磨儀中，對稱放置，確認放置平衡后，蓋好蓋子，選擇程序開始勻漿。

Tips

① 芝麻大小的組織，一般加入100-200μL 完全裂解液；綠豆大小組織加入 400-600μL 完全裂解液；黃豆大小組織加入 800-1000μL完全裂解液。

② Servicebio三維研磨儀參考參數(shù)：2mm 氧化鋯珠 8-12顆，頻率6.5m/s，時間30s。如果一次勻漿不徹底，可以再次勻漿）。如果組織塊比較大，可提前用剪刀將組織塊剪碎。

2 懸浮細胞提取蛋白

將細胞連帶培養(yǎng)基一起吸入 15mL 離心管（EP-1501-J）中，4℃，2000rpm，離心 5分鐘，去掉上清；

加入 1mL PBS 溶液（G4202-500ML）重懸細胞，將細胞轉(zhuǎn)移到 1.5mL 離心管（EP-150-M）中，然后 4℃，2000rpm，離心 5分鐘，去掉上清，保留沉淀，重復(fù)此步驟 2-3 次（此步驟目的為清洗細胞中殘留的培養(yǎng)基）；

根據(jù)細胞沉淀的量加入適量的完全裂解液，例如沉淀體積為綠豆大?。ù蟾?10uL 左右）的加入大約 200μL 完全裂解液，加入適量研磨珠，放入研磨儀進行裂解；

裂解完成后，12000rpm，4℃，離心 10分鐘，上清即為總蛋白溶液。

3 貼壁細胞提取蛋白

倒掉培養(yǎng)基，沿細胞培養(yǎng)皿側(cè)壁或者培養(yǎng)瓶瓶口慢慢加入 PBS 溶液，輕輕晃動平皿或者培養(yǎng)瓶，然后將細胞培養(yǎng)皿/瓶傾斜放置，用移液槍輕輕吸除殘余液體，盡量輕柔，不要將細胞沖掉，清洗 2-3 次，最后一次將殘余 PBS 完全吸干；

加入適當體積的完全裂解液（例如六孔板各單孔細胞長滿的話，加入大約 250μL完全裂解液），反復(fù)晃動細胞培養(yǎng)皿/瓶，讓裂解液與細胞完全接觸，用細胞刮刀將細胞刮下來，收集后，加入研磨珠，放入研磨儀中進行裂解；

裂解完成后，12000rpm，4℃，離心 10分鐘，上清即為總蛋白溶液。

蛋白定量

取適量上述步驟中未變性的總蛋白溶液，用 BCA 蛋白定量檢測試劑盒（G2026-200T；G2026-1000T）測蛋白濃度，蛋白濃度測定方法如下：

A.配制蛋白標準貯備液

取1 mL蛋白標準配制液加入到蛋白標準品（BSA）蛋白標準管中，將25 mg蛋白標準品完全溶解，即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標準貯備液。配制成的蛋白標準溶液可-20℃長期保存。

B.配制蛋白標準工作液

取適量25 mg/mL蛋白標準貯備液，用PBS或生理鹽水稀釋50倍，得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標準工作液。注意稀釋時按照10倍梯度方法稀釋，確保稀釋準確。

C.繪制標準曲線（酶標儀法）

將蛋白標準工作液分別按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理鹽水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL將上述梯度工作液補足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲線。

D.準備待測樣品

將待測的蛋白樣品進行適當稀釋（可通過預(yù)實驗檢測，使樣品蛋白濃度在標準曲線范圍內(nèi)，確保檢測結(jié)果可信），按照每個樣品20 μL的量加到96孔板中。待測樣品與蛋白標準品用相同溶液稀釋。

E.配制BCA顯色工作液

將BCA試劑與硫酸銅溶液按照50:1體積比充分混合均勻，得到BCA顯色工作液。BCA顯色工作液可室溫保存，24 h內(nèi)使用。每個待測樣品需200 μL，建議按需配制，避免浪費。

F.檢測

向標準曲線樣品孔及待測樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL，充分混勻（可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s），37℃反應(yīng)30 min后，以標準曲線0號做參比，在562 nm波長下比色測定，記錄各孔吸光度值。（注：也可以在室溫反應(yīng)2 h，或60℃反應(yīng)30 min。如果蛋白濃度較低，建議置于60℃反應(yīng)）

G.計算

以標準曲線中梯度蛋白含量（μg/mL）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線。根據(jù)所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應(yīng)孔中待測樣品的蛋白濃度（μg/mL），再乘以樣品稀釋倍數(shù)即為待測樣品實際蛋白濃度。

Tips

1. BCA法測定蛋白濃度受溫度和時間的影響較大，吸光度值會隨著時間的延長或溫度升高而變化，如果不能精確控制顯色反應(yīng)的時間和溫度，建議每次測定都需要做標準曲線。

2. 在進行蛋白標準貯備液的配制時，需確保溶解充分。稀釋配制蛋白標準工作液時建議10倍梯度稀釋，不要一次稀釋50倍，以免產(chǎn)生較大誤差。

3. 為保證蛋白的精確定量，樣品的提取和蛋白標準品的稀釋配制最好選用相同的緩沖液，同保證兩者檢測條件一致。如果緩沖液本身就有較高的背景值，建議使用其他的方法測定。

4. 操作時請穿實驗服，并佩戴一次性手套。