原理
以慢病毒包裝為例,主要包括 3 個(gè)質(zhì)粒:質(zhì)粒 DNA 可以轉(zhuǎn)錄出慢病毒遺傳物質(zhì)(RNA),但不能翻譯出慢病毒的外殼及蛋白成分的載體質(zhì)粒,其同時(shí)含有目的基因和報(bào)告基因,psPAX2 是可以表達(dá)慢病毒外殼的質(zhì)粒,其表達(dá)產(chǎn)物可通過(guò)粘附機(jī)制更易穿過(guò)細(xì)胞膜。
pMD2.G 為慢病毒的膜蛋白質(zhì)粒,通過(guò)脂質(zhì)體進(jìn)行三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到靶細(xì)胞基因組中,宿主基因組在表達(dá)時(shí),隨宿主基因轉(zhuǎn)錄出的目的基因 RNA 與 psPAX2、pMD2.G 基因翻譯出的蛋白組裝為慢病毒。病毒進(jìn)入細(xì)胞后,其遺傳物質(zhì) RNA 逆轉(zhuǎn)錄出 DNA,該基因再整合到靶細(xì)胞的基因組中,完成轉(zhuǎn)染過(guò)程。
因?yàn)橘|(zhì)粒 DNA 只能轉(zhuǎn)錄出病毒 RNA 和表達(dá)目的基因卻不能表達(dá)出病毒的外殼和膜蛋白成分,因此其不能像普通的病毒一樣在宿主細(xì)胞能反復(fù)增殖,故對(duì)宿主細(xì)胞是無(wú)害的并且高效的將目的基因轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞基因組中。
用途
病毒產(chǎn)生,包裝病毒。
材料與儀器
無(wú)菌 1 × PBS,對(duì)數(shù)期 293T 細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)器,病毒質(zhì)粒(以慢病毒為例:psPAX2/pMD2.G/載體質(zhì)粒),轉(zhuǎn)染試劑(lipMax 或者 lipo3000),Poly brene、病毒濃縮液(生物公司有售)等。
步驟
(1)293T 細(xì)胞鋪板
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 293T 細(xì)胞,用 0.05% 的胰蛋白酶消化 293T 細(xì)胞,計(jì)數(shù)。
若是 10 cm 大皿,建議按照 10-12 × 106 每皿的數(shù)量將 293T 細(xì)胞均勻鋪入。
若是 6 孔板,建議按照 2 × 106 每孔的數(shù)量將 293T 細(xì)胞均勻鋪入。
(2)第二天:在 24 小時(shí)之內(nèi),觀(guān)察 293T 細(xì)胞的匯合度在 90%~95% 之間時(shí),向其中加入 DNA-脂質(zhì)體復(fù)合體,DNA-脂質(zhì)體復(fù)合體制備方法如下:
a)輕輕混勻 LipoMax,根據(jù)說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)量于 500 μl Opti-MEM 無(wú)血清培養(yǎng)基中,混合均勻并置于室溫 5 分鐘。
b)在 500 μl Opti-MEM 無(wú)血清培養(yǎng)基中稀釋 DNA,總質(zhì)量為 15 μg 按照載體質(zhì)粒 : psPAX2 : pMD2.G = 4 : 3 : 1 的比例加入 DNA。
c)將稀釋后的 LipoMax 和稀釋后的 DNA 輕輕混勻,常溫靜置 20 分鐘,形成 DNA-LipoMax 復(fù)合體。
(3)將 DNA-LipoMax 復(fù)合體輕柔地滴加至細(xì)胞培養(yǎng)皿中,輕輕搖晃培養(yǎng)皿混勻,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(4)病毒收集
濃縮病毒:加入 DNA-LipoMax 復(fù)合體 48 小時(shí)后,收集病毒上清,同時(shí)加入 10 ml 預(yù)溫的 293T 培養(yǎng)基到細(xì)胞培養(yǎng)皿中。
將收集到的病毒上清存在 4 ℃ 冰箱中;收集 72 小時(shí)病毒上清,與 48 小時(shí)病毒上清混在一起。將離心機(jī)溫度降溫到 4 ℃,600 g,離心 5 分鐘,去除其中的細(xì)胞碎片,上清液經(jīng) 0.45 μm 濾頭過(guò)濾,加入病毒濃縮液,配制濃縮病毒液。
將濃縮后的病毒放于 4 ℃ 冰箱搖床上,旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。第二天,4 度離心機(jī),3000~4000 g 離心 15 分鐘。棄掉上清液,加入 1Xpbs 或培養(yǎng)基重懸。
注意事項(xiàng)
1. 病毒包裝的幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)主要包括:細(xì)胞因素、載體系統(tǒng)(盡量使用成熟的商業(yè)化載體系統(tǒng))、構(gòu)建重組的質(zhì)粒正確與否、質(zhì)粒抽提純化情況、包裝轉(zhuǎn)染控制(24、48 小時(shí)的細(xì)胞及熒光狀態(tài)判斷)、目的基因?qū)Σ《景b影響 (基因大小、序列情況、蛋白功能毒性等都會(huì)影響到是否能包裝成功)。
2. 293T 細(xì)胞狀態(tài)和鋪板時(shí)候的緊密會(huì)影響病毒包裝效率,需要觀(guān)察包裝病毒后的 48 h 培養(yǎng)基顏色是否橙紅。
3. 病毒濃縮:病毒一般在 48 h 和 72 h 各收一次。如果不想濃縮病毒的話(huà),也可以直接將收集的病毒上清作為要感染的細(xì)胞的培養(yǎng)基,但是可能效果會(huì)不太好。并且一般收病毒時(shí),培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)已經(jīng)損耗了很多,那樣直接培養(yǎng)感染細(xì)胞會(huì)損害細(xì)胞,所以建議還是進(jìn)行濃縮后再感染。
常見(jiàn)問(wèn)題
1. 包裝病毒時(shí) 293T 細(xì)胞狀態(tài)不好,或者鋪得過(guò)密,可以選擇放棄該次實(shí)驗(yàn)。
2. 目的載體過(guò)大,不易感染。
3. 避免轉(zhuǎn)染過(guò)程以及后續(xù)感染過(guò)程出現(xiàn)的污染。
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