一、實(shí)驗(yàn)材料
1,RNA待測(cè)樣本(注:本人用的是直接提取的RNA,為了實(shí)驗(yàn)更嚴(yán)謹(jǐn),應(yīng)當(dāng)先進(jìn)行mRNA純化)
2,無酶水
3,TBST(1×TBS, 0.1%Tween-20)
4,封閉液
5,一抗
6,二抗
7,ECL顯影液
8,亞甲藍(lán)染色緩沖液(0.4M醋酸鈉、0.4M醋酸中的0.2%亞甲藍(lán))
二,實(shí)驗(yàn)設(shè)備
無酶EP管
加熱設(shè)備
NC膜 或 帶正電荷的尼龍膜(建議使用尼龍膜,專門用來做核酸交聯(lián),效果比NC膜好)
干凈的塑料盒或者培養(yǎng)皿
烘箱或者帶有254nm燈泡的交聯(lián)設(shè)備(可用紫外線消毒燈代替,1m范圍內(nèi)有效)
顯影設(shè)備
三,流程
1,取出待測(cè)RNA樣本,解凍后測(cè)量RNA濃度,全程冰上操作。
2,將樣品濃度統(tǒng)一,并在新的無酶管連續(xù)稀釋樣品并混勻,稀釋梯度不固定,可自己試試最好效果。我選擇的終濃度為400/200/100 ng/μL 。
3,離心后,將RNA樣品95℃加熱3分鐘以破壞二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)束后立即冰上冷卻,防止重新形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。
4,用1ml槍頭粗端在NC膜上留下圓形印記,以引導(dǎo)加樣,隨后將NC膜裁剪成合適的尺寸,轉(zhuǎn)移至干凈的塑料盒中。
5,將2μl RNA樣品按順序滴在NC膜上,注意槍頭不要碰膜,樣品應(yīng)在膜上自然擴(kuò)散,每次加樣都需要更換槍頭。
6,室溫下NC膜上稍干燥后可進(jìn)行RNA與膜的交聯(lián)。方法一:37℃烘箱 30min。方法二:254nm波長(zhǎng)的紫外線燈下照射30min-1h。
7,10ml TBST清洗膜5min,洗去未結(jié)合的RNA。
8,棄去TBST,加入10ml封閉液,室溫?fù)u動(dòng)孵育1小時(shí)。
9,棄去封閉液,加入含有一抗的封閉液4℃孵育過夜。
10,10ml TBST清洗膜3次,每次10min。
11,二抗室溫孵育1小時(shí)。
12,同第10步。
13,ECL底物孵育5min
14,顯影儀下拍照
15,拍完照后,將膜放置于10ml亞甲藍(lán)染色緩沖液中,室溫?fù)u動(dòng)孵育30min
16,用ddH2O清洗至背景大致干凈即可,約30-60s
17,白光成像采集亞甲藍(lán)染色后的圖像作為負(fù)載對(duì)照。